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HDGF promueve la resistencia a gefitinib al activar las vías de señalización PI3K/AKT y MEK/ERK en no

Dec 22, 2023

Cell Death Discovery volumen 9, Número de artículo: 181 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

La expresión del factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF) está asociada con un mal pronóstico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC); sin embargo, aún se desconoce si HDGF afecta la resistencia a gefitinib en NSCLC. Este estudio tuvo como objetivo explorar el papel de HDGF en la resistencia a gefitinib en NSCLC y descubrir los mecanismos subyacentes. Se generaron líneas celulares estables de inactivación o sobreexpresión de HDGF para realizar experimentos in vitro e in vivo. Las concentraciones de HDGF se determinaron usando un kit ELISA. La sobreexpresión de HDGF exacerbó el fenotipo maligno de las células de NSCLC, mientras que la eliminación de HDGF ejerció los efectos opuestos. Además, las células PC-9, que inicialmente eran sensibles a gefitinib, se volvieron resistentes al tratamiento con gefitinib después de la sobreexpresión de HDGF, mientras que la eliminación de HDGF mejoró la sensibilidad a gefitinib en las células H1975, que inicialmente eran resistentes a gefitinib. Los niveles más altos de HDGF en plasma o tejido tumoral también indicaron resistencia a gefitinib. Los efectos de HDGF sobre la promoción de la resistencia a gefitinib fueron atenuados en gran medida por MK2206 (inhibidor de Akt) o U0126 (inhibidor de ERK). Mecánicamente, el tratamiento con gefitinib provocó la expresión de HDGF y activó las vías Akt y ERK, que eran independientes de la fosforilación de EGFR. En resumen, HDGF contribuye a la resistencia a gefitinib al activar las vías de señalización de Akt y ERK. Los niveles más altos de HDGF pueden predecir una eficacia deficiente para el tratamiento con TKI, por lo que tiene el potencial de servir como un nuevo objetivo para superar la resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa en la lucha contra el NSCLC.

El cáncer de pulmón es la causa más común de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa aproximadamente el 80 % de todos los casos de carcinoma de pulmón. Los pacientes con mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) responden bien a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI), pero todos los pacientes que responden eventualmente desarrollan resistencia adquirida a los TKI [1]. Los mecanismos subyacentes de la resistencia a TKI incluyen mutaciones de resistencia secundaria de genes específicos, activación de vías de señalización de derivación, desregulación de efectores posteriores y transformación fenotípica [2]. La mutación T790M en el exón 20 de EGFR representa aproximadamente el 50 % de los casos resistentes y es el mecanismo de resistencia predominante de los TKI. Sin embargo, aproximadamente el 19% de los mecanismos de resistencia siguen siendo desconocidos [3].

El factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF) es un factor de crecimiento de unión a heparina que se identificó por primera vez a partir del medio acondicionado de la línea celular de hepatoma Huh-7 [4], lo que indica que puede secretarse. Se ha informado que el HDGF está involucrado en el crecimiento de células cancerosas, la angiogénesis, la antiapoptosis y la metástasis tumoral [4, 5]. En una variedad de tipos de tumores, incluidos el NSCLC, el cáncer de ovario, el cáncer oral, el cáncer gástrico y el melanoma, el HDGF se sobreexpresa y su mayor expresión se correlaciona fuertemente con un mal pronóstico [6,7,8,9,10,11]. HDGF mejora la angiogénesis dependiente del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en NSCLC [12], y los niveles séricos altos de HDGF predicen metástasis óseas y un pronóstico desfavorable en NSCLC [13]. En el NSCLC en estadio I extirpado quirúrgicamente, el HDGF se considera un biomarcador molecular para la estadificación y el pronóstico y proporciona una predicción para la quimioterapia adyuvante posoperatoria [14]. La inhibición de HDGF suprimió el crecimiento de células tumorales tanto in vitro como in vivo [15, 16]. Los anticuerpos dirigidos al HDGF podrían prevenir la recaída del NSCLC después de la quimioterapia al suprimir las células madre del cáncer [17, 18]. Algunos microARN (miARN) inhiben la proliferación y la invasión del NSCLC al dirigirse al HDGF [19,20,21]. Por lo tanto, HDGF es un objetivo potencial prometedor para el tratamiento de NSCLC.

Nuestro experimento anterior demostró que el extracto de Marsdenia tenacissima (MTE) podría superar la resistencia al gefitinib, un TKI de primera generación ampliamente utilizado, en NSCLC in vitro e in vivo [22, 23]. Mientras tanto, MTE podría perturbar la interacción entre los macrófagos asociados al tumor y las células de NSCLC al dirigirse al HDGF [24]. Nuestro estudio preliminar mostró que MTE combinado con gefitinib podría disminuir la expresión de HDGF en células H1975 resistentes, como lo demuestra la electroforesis en gel 2D junto con cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) y transferencia Western (Fig. S1 ). Los estudios han indicado que el HDGF promueve la resistencia a la quimioterapia en las células de cáncer colorrectal y el carcinoma de células escamosas de la lengua [25, 26], y genera radiorresistencia en el cáncer de mama [27]. Sin embargo, el papel de HDGF en la resistencia a gefitinib no está claro. Aunque los reporteros de péptidos específicos del sitio y la espectrometría de masas dirigida indicaron que HDGF-S165, un péptido de sustrato sintético, puede tener una asociación potencial con la resistencia a TKI [28], no hay evidencia directa que asocie los niveles de HDGF y la eficacia de TKI. En este estudio, demostramos la correlación entre HDGF y la resistencia a gefitinib in vitro e in vivo e identificamos el efecto complementario entre HDGF y EGFR en células de NSCLC.

A través de análisis de gel 2D y LC-MS/MS, HDGF se identificó como una de las proteínas expresadas diferencialmente en células H1975 tratadas con gefitinib o MTE solos o en combinación (Fig. S1). Los estudios han indicado que la expresión de HDGF se considera un factor pronóstico en pacientes con NSCLC en etapa temprana [6]; HDGF también promueve la resistencia a la quimioterapia en algunos tumores, incluidos el cáncer colorrectal, el cáncer de células escamosas de la lengua y el cáncer de mama [25,26,27]. Por lo tanto, elegimos HDGF como la proteína objetivo para un estudio adicional. Los resultados de Western blot mostraron que HDGF se reguló significativamente después de la exposición al tratamiento combinado de gefitinib y MTE en comparación con cada tratamiento individual y el grupo de control en células H1975 (Fig. S1).

Para comprender mejor la función de HDGF en NSCLC, detectamos su expresión en siete líneas celulares de NSCLC con diferentes respuestas a gefitinib. Las células PC-9 y H292 sensibles a gefitinib tenían una expresión de HDGF relativamente más baja, mientras que las células H1975 expresaban niveles muy altos de HDGF (Fig. S1). El sistema CRISPR/Cas9 eliminó HDGF en células H1975, mientras que la sobreexpresión estable de HDGF se estableció mediante la transfección del plásmido HDGF plenti6-TR en células PC-9 y H292. La sobreexpresión o eliminación de HDGF se validó mediante transferencia Western y qRT‒PCR (Figs. 1A, 1B).

El sistema CRISPR/Cas9 eliminó HDGF en células H1975, mientras que se sobreexpresó en células PC-9 y H292 al transfectar el plásmido plenti6-TR. La expresión de HDGF se detectó mediante transferencia Western (A) y qRT‒PCR. B Se detectó proliferación de células NSCLC con diferentes niveles de expresión de HDGF (C) o estimuladas con 5 ng de rhHDGF (D) a las 24, 48, 72 y 96 h. E Habilidades de formación de colonias de células NSCLC con diferentes niveles de expresión de HDGF. F Muestra los resultados analíticos de E. G Las capacidades de migración e invasión de las células HDGF-knockdown H1975 se determinaron mediante el ensayo Transwell. H Muestra los resultados analíticos de (G). Se determinaron las capacidades de migración e invasión en células PC-9 y H292 que sobreexpresan HDGF. J muestra los resultados analíticos de (I). Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 frente al control.

Para comprender la influencia de los niveles de HDGF en las características biológicas de las células de NSCLC, medimos los fenotipos celulares después de la eliminación o sobreexpresión de HDGF. Como se muestra en la Fig. 1, HDGF sgRNA1 y sgRNA2 inhibieron significativamente H1975 la proliferación celular (Fig. 1C), la formación de colonias (Fig. 1E, F) y las capacidades de migración e invasión (Fig. 1G, H) (P < 0.01, P < 0,001 frente al control), lo que indica que la eliminación de HDGF redujo las propiedades malignas de las células de NSCLC. Por el contrario, la proliferación de células H292 y PC-9 fue promovida por la sobreexpresión de HDGF (Fig. 1C) o estimulada con rhHDGF (Fig. 1D). Mientras tanto, la sobreexpresión de HDGF amplificó la formación de colonias (Fig. 1E, F) y las capacidades de migración e invasión (Fig. 1I, J) de las células H292 y PC-9 (P < 0.01, P < 0.001 vs. control). Por lo tanto, los datos anteriores demostraron que HDGF promovió el fenotipo maligno de las células NSCLC.

Determinamos la asociación entre HDGF y el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto. Como se muestra en la Fig. 2, en comparación con el grupo de control, ambos sgRNA HDGF redujeron significativamente el crecimiento del tumor (Fig. 2A-C), y el efecto inhibitorio fue más evidente en el grupo sgRNA2, lo que indica que la eliminación de HDGF restringió el desarrollo del tumor H1975 . Mientras tanto, la transferencia de Western confirmó que la expresión de HDGF fue inhibida por ambos sgRNA en tejidos tumorales H1975 (Fig. 2D, E). Por el contrario, la sobreexpresión de HDGF aumentó notablemente el volumen y el peso del tumor PC-9 en comparación con el grupo de control (Fig. 2F-H). Los ensayos de transferencia Western también confirmaron niveles más altos de HDGF en tejidos tumorales PC-9 (Fig. 2I, J). Los resultados anteriores indicaron que HDGF promovió el crecimiento tumoral pero que la eliminación de HDGF podría restringir este proceso.

A Imágenes representativas de tumores de xenoinjerto H1975 con eliminación de HDGF. B, C Muestra el volumen del tumor del xenoinjerto H1975 y el peso del tumor. D Expresión de la proteína HDGF en tejidos tumorales de ratón H1975. E Muestra los resultados analíticos de (D). F Imágenes representativas de tumores de xenoinjerto PC-9 en ratones desnudos con sobreexpresión de HDGF. G, H Muestra el volumen del tumor del xenoinjerto PC-9 y el peso del tumor. Expresión de la proteína I HDGF en tejidos tumorales de ratón PC-9. J Muestra los resultados analíticos de I. La expresión de p-Akt y p-ERK en células H1975 y PC-9 (K) o tejidos tumorales de ratón (L) con eliminación o sobreexpresión de HDGF. M, N Muestre los resultados analíticos de (K, L). El inhibidor de Akt MK2206 o el inhibidor de ERK1/2 U0126 anularon o revirtieron la sobreexpresión de O, P HDGF o el crecimiento celular H292 y PC-9 inducido por rhHDGF. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 frente al control.

Los estudios han demostrado que las moléculas posteriores de EGFR p-Akt y p-ERK se activan de manera anormal cuando el NSCLC ejerce resistencia al gefitinib [29]. En nuestro experimento, se determinaron alteraciones en estas dos moléculas en células de NSCLC y tejidos tumorales de ratón. En comparación con el grupo de control, la eliminación de HDGF resultó en una disminución drástica de la expresión de p-Akt y p-ERK en células H1975, y sgRNA2 mostró un efecto inhibidor más potente. Por el contrario, la sobreexpresión de HDGF aumentó los niveles de p-Akt y p-ERK en células H292 y PC-9 (Fig. 2K, M). En tejidos tumorales de ratón, los cambios en p-Akt y p-ERK fueron consistentes con los de las líneas celulares (Fig. 2L, N). En presencia del inhibidor de Akt MK2206 o el inhibidor de ERK U0126, el aumento del crecimiento inducido por la sobreexpresión de HDGF o rhHDGF en células H292 y PC-9 se anuló o invirtió (Fig. 2O, P).

Después de comprender el papel de HDGF en NSCLC, estudiamos más a fondo la asociación entre la expresión de HDGF y la eficacia de gefitinib. Como se muestra en la Fig. 3A, la eliminación de HDGF por sgRNA en células H1975 respondió bien a gefitinib, con valores de IC50 de 2,21 μM y 1,08 μM, respectivamente, en comparación con 7,30 μM en el grupo de control de sgRNA. Por el contrario, HDGF aumentó los valores de IC50 de gefitinib en 17 y 20 veces en comparación con las células H292 y PC-9 parentales sensibles a gefitinib (Fig. 3B, C). El tratamiento con gefitinib suprimió notablemente la formación de colonias y las capacidades de migración e invasión en células H1975 silenciadas con HDGF, pero solo ejerció influencias menores en el grupo de control (Fig. 3D, G, J, M). Por el contrario, el tratamiento con gefitinib redujo la formación de colonias (Fig. 3E, F, H, I) y las capacidades de migración e invasión (Fig. 3K, L, N, O) de las células H292 y PC-9, pero estos efectos inhibitorios se anularon después de Sobreexpresión de HDGF. Los resultados anteriores sugirieron que una mayor expresión de HDGF puede estar asociada con la resistencia a gefitinib.

Las células A–C H1975, PC-9 y H292 se trataron con 0,001 ~ 50 μM de gefitinib durante 72 h. Se detectó la capacidad de formación de colonias de células D-F NSCLC después del tratamiento con gefitinib. G–I Mostrar los resultados analíticos de D–F. Se detectaron capacidades de migración e invasión de células J-L NSCLC después del tratamiento con gefitinib durante 24 h. M–O Mostrar los resultados analíticos de JL. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 frente al control.

Para evaluar la correlación entre HDGF y la eficacia de gefitinib in vivo, llevamos a cabo experimentos en ratones implantados con células NSCLC con eliminación o sobreexpresión de HDGF. Como se muestra en la Fig. 4A-C, el tratamiento con 50 mg/kg de gefitinib no produjo un efecto antitumoral evidente en los xenoinjertos H1975. Sin embargo, causó una reducción significativa del tumor en el grupo HDGF sgRNA2, lo que sugiere que la eliminación de HDGF mejoró la sensibilidad de gefitinib. Por el contrario, en los xenoinjertos de PC-9 sensibles a gefitinib, la expresión estable de HDGF resultó en un crecimiento tumoral rápido en comparación con el grupo de control, pero el efecto promotor de tumores de HDGF se redujo con la administración de 10 mg/kg de gefitinib (Fig. 4D-F). Sin embargo, la regresión del tumor se produjo tanto en el grupo de sobreexpresión de HDGF como en el de control, lo que puede deberse a la dosis relativamente alta de gefitinib utilizada en este experimento porque las células PC-9 son muy sensibles a gefitinib. Sin embargo, la sobreexpresión de HDGF aún resultó en un crecimiento tumoral más rápido que el observado en el grupo de control después del tratamiento con gefitinib (P < 0.05), lo que implica que el aumento de HDGF anuló la eficacia de gefitinib hasta cierto punto. Como se muestra en la Fig. 4G, la expresión de Ki-67 y HDGF en tejidos tumorales de ratón mostró patrones similares al volumen y peso del tumor en xenoinjertos H1975 y PC-9.

Se inocularon células de NSCLC por vía subcutánea en ratones desnudos, a los que luego se les administró gefitinib durante los días consecutivos indicados después de la formación del tumor. Volumen del tumor, imágenes representativas de los tumores y peso del tumor de xenoinjertos H1975 de eliminación de HDGF tratados con 50 mg/kg de gefitinib (A–C) o xenoinjertos de PC-9 que sobreexpresan HDGF tratados con 10 mg/kg de gefitinib (D–F). Niveles de expresión de G HDGF y Ki-67 en tejidos tumorales H1975 y PC-9 (20x). H, I Concentraciones de HDGF en plasma en xenoinjertos H1975 y PC-9. J, K Concentraciones plasmáticas de HDGF en pacientes con NSCLC antes de recibir gefitinib o AZD9291 (un TKI de tercera generación) y después de que ocurriera la resistencia a los medicamentos. L, M Niveles plasmáticos de HDGF en cada paciente antes y después de recibir gefitinib o AZD9291. Expresión de N HDGF en muestras de tejido de biopsia medida por IHC antes del tratamiento con TKI y después de la progresión de la enfermedad. El paciente n.º 1 recibió tratamiento con icotinib y el paciente n.º 2 recibió AZD9291. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al control.

Debido a que HDGF es una proteína secretora, detectamos sus concentraciones en el plasma de ratones portadores de tumores NSCLC para explorar si los niveles de HDGF en plasma son relevantes para la eficacia de gefitinib. Como se muestra en la Fig. 4H, I, la concentración de HDGF en plasma de ratón fue paralela a la eficacia de gefitinib. También analizamos preliminarmente las concentraciones plasmáticas de HDGF en ocho pacientes con NSCLC antes y después de tomar gefitinib como monoterapia. Como se muestra en la Fig. 4J, K, en comparación con la línea de base, cada uno de los casos y sus niveles promedio de HDGF en plasma se elevaron obviamente cuando se produjo la resistencia a los fármacos. Además, medimos las concentraciones plasmáticas de HDGF en cinco pacientes con NSCLC antes y después de recibir AZD9291, un TKI de tercera generación, hasta que desarrollaron resistencia a los medicamentos. Los resultados fueron similares a los observados en pacientes con NSCLC con resistencia adquirida a gefitinib (Fig. 4L, M). La expresión de HDGF se detectó en muestras de biopsia pareadas antes y después del tratamiento con TKI. Lo emocionante es que el HDGF se expresó en gran medida en los dos casos en los que se produjo la resistencia a los TKI, lo que sugiere que los niveles más altos de HDGF pueden predecir una eficacia deficiente del tratamiento con TKI. Sin embargo, solo se analizaron muestras limitadas en el presente estudio y se necesitan más muestras clínicas para verificar este resultado.

Para explorar los mecanismos de la resistencia a gefitinib impulsada por HDGF, determinamos las proteínas asociadas a la resistencia a gefitinib p-Akt y p-ERK en células de NSCLC (Fig. 5A) y tejidos tumorales de ratón (Fig. 5B). La eliminación de HDGF redujo notablemente la expresión de p-Akt y p-ERK, y este efecto se fortaleció aún más con gefitinib, que por sí solo aumentó la fosforilación de Akt y ERK en las células H975. Por el contrario, aunque gefitinib inhibió prominentemente p-Akt y p-ERK en células H292 y PC-9, no pudo revertir la fosforilación escalada de Akt y ERK causada por la sobreexpresión de HDGF. Los datos anteriores respaldaron además que los niveles de HDGF estaban asociados con la señalización relacionada con la resistencia a gefitinib.

La expresión de p-Akt y p-ERK en células de NSCLC (A) o tejidos tumorales de xenoinjerto (B) con silenciamiento o sobreexpresión de HDGF después del tratamiento con gefitinib. C Viabilidad celular de células PC-9 tratadas con gefitinib 1 µM durante 24 h en presencia de rhHDGF, MK2206 (inhibidor de Akt, 0,5 µM) o U0126 (inhibidor de ERK1/2, 5 µM). D El plásmido de mutación pcDNA3.1-EGFR T790M y el vector de sobreexpresión de HDGF, solos o juntos, se introdujeron en la célula PC-9 y luego se trataron con gefitinib durante 72 h. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al control.

Los resultados anteriores mostraron que el crecimiento celular inducido por HDGF fue anulado o revertido por los inhibidores de la vía Akt o ERK. En la Fig. 5C, hemos agregado MK2206 (un inhibidor de Akt) o U0126 (un inhibidor de ERK) para validar si HDGF promueve la resistencia a gefitinib a través de estas dos vías de señalización. Los resultados mostraron que el tratamiento con HDGF disminuyó la sensibilidad de las células PC-9 al gefitinib; sin embargo, los efectos potenciadores de HDGF sobre la resistencia a gefitinib fueron atenuados en gran medida por MK2206 o U0126, lo que sugiere que HDGF puede inducir resistencia a gefitinib a través de la vía de señales Akt y ERK.

La mutación EGFR T790M es el principal mecanismo de resistencia a gefitinib. Para explorar si HDGF está implicado en la resistencia a gefitinib mediada por T790M, el plásmido de mutación pcDNA3.1-EGFR T790M y el vector de sobreexpresión de HDGF solos o juntos se introdujeron en las células PC-9. En la Fig. 5D, nuestros resultados mostraron que la mutación T790M o la sobreexpresión de HDGF por sí sola dieron como resultado resistencia a gefitinib con valores de CI50 de 0,107 µM y 0,181 µM, respectivamente. Más importante aún, cuando las células PC-9 se sometieron tanto a la mutación T790M como a la sobreexpresión de HDGF, la resistencia a gefitinib (IC50 = 0,253 µM) mejoró más que en las células con una sola mutación T790M o sobreexpresión de HDGF. Estos resultados sugieren que la resistencia a gefitinib causada por la mutación T790M o la sobreexpresión de HDGF puede no compartir un mismo mecanismo. Por lo tanto, HDGF puede no estar involucrado en la resistencia a gefitinib iniciada por la mutación T790M.

Descubrimos que silenciar o sobreexpresar HDGF afectaba la activación de Akt y ERK aguas abajo de EGFR, que está relacionada con la resistencia a TKI. Luego, preguntamos si existe diafonía entre HDGF y EGFR. Primero, buscamos Pathcards en la base de datos de GeneCards (http://www.genecards.org) y, como era de esperar, encontramos que la mayoría de las vías de HDGF se superponían con EGFR, incluida la señalización de Akt y ERK (Fig. 6A). A continuación, encontramos que los niveles de p-EGFR estaban inversamente correlacionados con la eliminación o sobreexpresión de HDGF en células de NSCLC y tejidos tumorales (Fig. 6B, C). Gefitinib inhibió el p-EGFR pero mejoró el HDGF de forma dependiente de la dosis en las células de NSCLC analizadas, excepto en las células H157, que tienen niveles de expresión de p-EGFR y HDGF extremadamente bajos (Fig. 6D, E), lo que indica que la elevación del HDGF inducida por gefitinib solo se produjo en células de EGFR- células de NSCLC dependientes. Paralelamente, las concentraciones de HDGF secretado en los sobrenadantes de las células NSCLC analizadas, excepto las células H157, también aumentaron después del tratamiento con gefitinib (Fig. 6F).

A Las vías superpuestas entre HDGF y EGFR se recuperaron de la base de datos GeneCards. La expresión de EGFR se detectó en células de NSCLC (B) y tumores de xenoinjerto (C) con eliminación o sobreexpresión de HDGF. Los niveles de expresión de p-EGFR y HDGF se determinaron en líneas celulares de NSCLC (D) y células de NSCLC tratadas con gefitinib durante 24 h (E). Concentraciones de F HDGF en los sobrenadantes de células de NSCLC después del tratamiento con gefitinib durante 24 h. Cambios en la expresión de HDGF y p-EGFR en células de NSCLC tratadas con gefitinib (G) y tejidos tumorales de xenoinjerto (H) con eliminación y sobreexpresión de HDGF. I, J Muestre los resultados analíticos de G, H. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al control.

Luego preguntamos si HDGF y EGFR tienen funciones complementarias en la respuesta a gefitinib en células de NSCLC con pérdida y ganancia de HDGF. Como se muestra en la Fig. 6G, I, la eliminación de HDGF provocó una disminución en la expresión de HDGF, y el tratamiento con gefitinib en células H1975 revirtió la regulación positiva de p-EGFR. En las células H292 y PC-9, la sobreexpresión de HDGF resultó en una elevación de HDGF y una supresión de p-EGFR, y el tratamiento con gefitinib inhibió aún más el p-EGFR pero sin una influencia obvia en la expresión de HDGF. Como se muestra en la Fig. 6H, J, HDGF aumentó con la administración de gefitinib en tumores de xenoinjerto PC-9 con sobreexpresión de HDGF (P < 0,05), y otros cambios en HDGF y p-EGFR en tejidos tumorales fueron consistentes con los experimentos celulares. Por lo tanto, los datos anteriores indican diafonía entre HDGF y EGFR en NSCLC, y HDGF puede servir como una molécula de señalización de derivación de EGFR para activar las moléculas Akt y ERK corriente abajo. Además, HDGF y EGFR tienen funciones complementarias en el mantenimiento de la supervivencia de las células tumorales expuestas a gefitinib. La función de HDGF en la resistencia a gefitinib se ilustra mediante un diagrama esquemático en la Fig. 7.

Diagrama esquemático de la contribución de HDGF a la resistencia a gefitinib mediante la activación de moléculas aguas abajo de EGFR como derivación en NSCLC.

En el presente estudio, encontramos que los niveles más altos de HDGF no solo están asociados con el fenotipo maligno de NSCLC, sino que también pueden inducir resistencia a gefitinib. La señalización relacionada con la resistencia a TKI, como las vías PI3K/Akt y MEK/ERK, podría ser activada por bypass por HDGF de manera independiente a EGFR. Además, la supresión de HDGF aumentó la eficacia de gefitinib en células de NSCLC resistentes tanto in vitro como in vivo, lo que sugiere que HDGF es un objetivo potencial para superar la resistencia a gefitinib.

Primero, nuestro estudio demostró que HDGF promovió la tumorigénesis de NSCLC y facilitó la metástasis. En las células H292 y PC-9, que tienen niveles relativamente bajos de expresión de HDGF, la expresión forzada de HDGF aumentó la proliferación celular, la formación de colonias y las capacidades de migración e invasión. Mientras tanto, la expresión exógena de rhHDGF mejoró la proliferación de células H292 y PC-9, lo que confirma el papel de HDGF como estimulador del crecimiento. La función de tumorigénesis de HDGF también se confirmó en ratones con xenoinjerto PC-9 que sobreexpresan HDGF. Por el contrario, el silenciamiento del HDGF mediante CRISPR inhibió el fenotipo maligno de las células H1975 y retrasó el desarrollo tumoral in vivo. Los estudios han demostrado que dirigirse al HDGF mediante miARN o anticuerpos es eficaz para inhibir el crecimiento del NSCLC [16, 19, 20, 21] o el carcinoma de células escamosas de pulmón [30]. Sin embargo, hasta ahora, la mayoría de los estudios sobre HDGF se han centrado principalmente en su función tumorigénica, mientras que solo se ha prestado una atención limitada a la determinación de su función en la resistencia a la terapia contra el cáncer. Como se informó, HDGF participó en el desarrollo de resistencia a los fármacos de quimioterapia en el cáncer colorrectal [25] y el carcinoma de células escamosas de la lengua [26] o promovió la radiorresistencia en el cáncer de mama [27]. La inhibición del HDGF con el polifenol del té verde (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG) podría aumentar la respuesta del NSCLC a la quimioterapia [31].

Gefitinib es un EGFR-TKI de primera generación ampliamente utilizado para pacientes con NSCLC con mutaciones sensibles a EGFR, pero la inevitable resistencia a los medicamentos obstaculiza sus beneficios clínicos. Los principales mecanismos que explican la resistencia a TKI incluyen alteraciones en los objetivos de los fármacos, como T790M, que representa la mitad de todos los casos de resistencia adquirida, mientras que la activación de la señalización de derivación comprende del 20 al 25% de todos los casos [32]. Sin embargo, todavía hay aproximadamente un 15-20% de pacientes con NSCLC en los que no se han identificado mecanismos para la resistencia adquirida a los inhibidores de la tirosina quinasa [29]. Nuestros resultados revelaron que la eliminación de HDGF podría aumentar la sensibilidad de gefitinib, mientras que el aumento de HDGF anuló la eficacia de gefitinib hasta cierto punto en NSCLC. En detalle, la eliminación de HDGF inhibió el crecimiento tumoral en células H1975 in vitro e in vivo, mientras que la sobreexpresión de HDGF retrasó la respuesta de gefitinib en células PC-9. La tinción inmunohistoquímica de Ki-67 y HDGF en secciones de tejido tumoral de ratón fue consistente con los resultados anteriores. Por lo tanto, nuestros datos indicaron que la expresión de HDGF se correlacionó con la eficacia de gefitinib en NSCLC. Estos resultados fueron respaldados en parte por un estudio reciente que proporciona algunas pistas sobre la resistencia a HDGF-S165 y TKI a través de indicadores de péptidos específicos del sitio y espectrometría de masas dirigida al nivel de nanogramos en las células [28].

Los niveles séricos altos de HDGF predijeron la metástasis ósea y el pronóstico desfavorable en el NSCLC [13]. Primero, encontramos una correlación paralela entre los niveles de HDGF en plasma y el efecto antitumoral de gefitinib en xenoinjertos de NSCLC. En un pequeño número de muestras clínicas, los niveles de HDGF también estaban elevados en la sangre periférica de pacientes con NSCLC que tomaron gefitinib y AZD9291 después de que ocurriera la resistencia a los medicamentos. Mientras tanto, la sobreexpresión de HDFG se asoció con la resistencia a gefitinib en muestras clínicas. Por lo tanto, HDGF está involucrado en la resistencia a gefitinib, y los niveles de HDGF en plasma o muestras de tejido pueden predecir la eficacia de TKI hasta cierto punto. Sin embargo, en el presente estudio solo se analizaron muestras clínicas limitadas; por lo tanto, se necesitan más muestras clínicas para verificar estos resultados.

La señalización de PI3K/Akt y MAPK/ERK son las principales vías descendentes de EGFR que conducen a la proliferación celular. Los TKI se unen al dominio de tirosina quinasa de EGFR y bloquean la señalización impulsada por EGFR aguas abajo para ejercer sus efectos inhibidores de tumores. La mutación EGFR T790M interfiere con la interacción al aumentar su afinidad por el ATP para conferir resistencia a gefitinib [33]. En condiciones independientes de EGFR, la desregulación de otras tirosina quinasas receptoras o la activación anormal de señales aguas abajo tiene una función compensatoria para anular la inhibición de EGFR y da como resultado resistencia a TKI [3]. La vía de señalización de derivación comparte las mismas vías aguas abajo con EGFR y converge para activar los ejes de señalización PI3K/Akt y MAPK/ERK [30, 34]. Una gran cantidad de estudios han demostrado una activación aberrante de p-Akt y p-ERK cuando se produce resistencia a EGFR-TKI [29], pero restringir la expresión de p-Akt y p-ERK podría recuperar la sensibilidad a gefitinib en NSCLC [35, 36]. En el presente estudio, la eliminación de HDGF inhibió la fosforilación de Akt y ERK, mientras que la sobreexpresión de HDGF ejerció el efecto opuesto, lo que sugiere que regula la activación de p-Akt y p-ERK. En células de NSCLC sensibles a gefitinib, los niveles de p-Akt y p-ERK restringidos por gefitinib fueron anulados por la sobreexpresión de HDGF; sin embargo, en células H1975 resistentes, la activación de Akt y ERK fue fuertemente suprimida por el agotamiento de HDGF. Se usaron inhibidores de Akt o ERK para validar si HDGF inducía el crecimiento celular y la resistencia a gefitinib por estas dos vías. Estos datos indicaron que HDGF podría mejorar la señalización de p-Akt y p-ERK aguas abajo de EGFR, que está relacionada con la resistencia a gefitinib.

Dado que tanto EGFR como HDGF regulan la activación de Akt y ERK, no nos sorprendió descubrir que la mayoría de las vías conocidas de HDGF se superponían con EGFR, incluida la señalización de Akt y ERK, al buscar en GeneCards (https://www.genecards.org ). Esto es consistente con un estudio en células de cáncer de ovario en el que el HDGF extracelular estimuló la fosforilación de ERK [37] y promovió el desarrollo y la progresión del tumor mediante la regulación de la vía PI3K-Akt en células de cáncer de vejiga [38]. Las células tumorales suelen orquestar una red de vías de señalización para mantener su supervivencia cuando se enfrentan a la muerte causada por la terapia contra el cáncer. Cuando la vía dominante, como EGFR, es inhibida por un TKI, las células tumorales tienden a activar el efector crítico aguas abajo a través de vías de señalización de derivación, manteniendo la supervivencia y el crecimiento celular continuos [39]. En el presente estudio, encontramos que los niveles de expresión de HDGF y p-EGFR eran complementarios entre sí en las células de NSCLC con o sin pérdida y ganancia de HDGF. El tratamiento con gefitinib podría reducir la fosforilación de EGFR pero aumentar la expresión de HDGF, activando de forma anómala las vías PI3K/Akt y MEK/ERK. Sin embargo, la eliminación de HDGF en células H1975 podría reactivar EGFR y disminuir HDGF cuando se exponen a gefitinib, lo que sugiere un delicado equilibrio y complementariedad entre HDGF y p-EGFR en células de NSCLC dependientes de EGFR cuando se exponen a gefitinib. Teniendo en cuenta toda la información relevante, el aumento de los niveles de HDGF puede servir como una señal de supervivencia de derivación para desencadenar la resistencia a gefitinib, y la resistencia a los medicamentos puede superarse silenciando el HDGF.

En resumen, la presente investigación encontró que HDGF no solo promovió el fenotipo maligno de las células de NSCLC, sino que también contribuyó a la resistencia a gefitinib. Como vía de señalización compensatoria y de derivación, HDGF activa las vías PI3K/Akt y MEK/ERK aguas abajo del EGFR, que están asociadas con la resistencia a gefitinib. Dirigirse a HDGF podría restaurar la sensibilidad de gefitinib a través de un delicado equilibrio entre la expresión de HDGF y la reactivación de EGFR, así como sus moléculas aguas abajo compartidas. Por lo tanto, HDGF puede considerarse como un posible mecanismo subyacente de la resistencia a gefitinib y es un objetivo prometedor tanto contra NSCLC como para aumentar la eficacia de TKI en NSCLC.

Las líneas celulares de NSCLC humano H1975, H157, H460, H292 y PC-9 se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, EE. UU.), mientras que las células A549 y H1650 se obtuvieron de National Infrastructure of Cell Line Resource (Beijing, China). Todas las células se mantuvieron en RPMI-1640 con suero fetal bovino (FBS) al 10 % a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %.

Gefitinib se obtuvo de AstraZeneca (Cheshire, Reino Unido). Los anticuerpos contra Akt (9272), ERK1/2 (9102) y p-ERK1/2 (T202/Y204) (9101) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). HDGF y p-Akt (Ser473) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). EGFR y p-EGFR se adquirieron de ABclonal (Wuhan, China). GAPDH, β-actina, β-tubulina y Ki-67 se adquirieron de TDYbio (Beijing, China). El HDGF humano recombinante (rhHDGF) se obtuvo de ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Israel).

El plásmido HDGF recombinante en el vector lentiviral pLenti6/TR (Invitrogen) y el plásmido mutado pcDNA3.1-EGFR T790M se obtuvieron mediante clonación molecular. El ARN de guía única (sgRNA) para HDGF se ligó en el plásmido lentiCRISPRv2. Las células de NSCLC se transfectaron con plásmido y se seleccionaron para generar una línea celular estable para estudios posteriores. Las secuencias para HDGF sgRNA1, sgRNA2, control sgRNA (sgRNA-Con) y otros cebadores se enumeran en las tablas S1 y S2.

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). qRT‒PCR se realizó como se describió anteriormente [40]. Las secuencias de los cebadores de HDGF y GAPDH se presentan en la Tabla S2.

La influencia de la eliminación o sobreexpresión de HDGF, así como la inducción de rhHDGF en el crecimiento de células NSLCL, se determinó contando el número de células. El ensayo MTT se utilizó para evaluar la inhibición del crecimiento celular después del tratamiento con gefitinib. Brevemente, 1 × 104 células en placas de 96 pocillos se trataron con gefitinib (0,001 ~ 50 μM) durante 72 h. Se midió la densidad óptica a 570 nm y los valores de IC50 se calcularon mediante el software GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA).

Las células se sembraron en placas de cultivo de 6 cm a razón de 200 células por placa. Después de 14 días de incubación, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con cristal violeta, y las colonias (diámetro > 40 μm) se contaron y compararon.

Los experimentos se realizaron en una cámara Boyden de 24 pozos como se describió anteriormente [40]. Las células se usaron a una densidad de 3 × 104 para ensayos de migración e invasión sin o con Matrigel. Se tomaron fotografías de cuatro campos seleccionados al azar y se contaron los números de células bajo un microscopio.

Immunoblotting se llevó a cabo como se describe anteriormente [22]. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorado y sus intensidades se midieron con el software ImageJ.

Todos los animales se obtuvieron de Beijing HFK Bioscience Co. Ltd., (China) y se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales utilizando el número aleatorio generado por Excel. Los xenoinjertos de NSCLC se establecieron mediante la inoculación subcutánea de células en mic desnudo macho BALB/c de 6 a 8 semanas (SCXK-2016-006). Cuando los volúmenes del tumor alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, los ratones se dividieron al azar y se trataron como se describe a continuación. Al final de la prueba, se sacrificaron los ratones y se recogieron el plasma y los tumores para su posterior análisis.

Los ratones se dividieron en tres grupos y se les implantaron células H1975 (5 × 105) con control de sgRNA, sgRNA1 o sgRNA2. Otros ratones fueron inoculados con células PC-9 (8 × 105) que sobreexpresan HDGF o su vector de control. El efecto de la eliminación de HDGF en la eficacia de gefitinib en células H1975 se evaluó en cuatro grupos de ratones: control de sgRNA o sgRNA2 tratados con gefitinib (50 mg/kg) o vehículo. El efecto de la sobreexpresión de HDGF sobre la eficacia de gefitinib en células PC-9 se evaluó en cuatro grupos: control de vector o sobreexpresión de HDGF tratada con gefitinib (10 mg/kg) o vehículo. Los datos de volumen tumoral se recogieron de forma ciega. El estudiante que midió el volumen del tumor no tenía idea de la información del grupo.

Las concentraciones de HDGF en plasma de ratón se evaluaron mediante un kit de Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Los niveles de HDGF en el plasma de pacientes con NSCLC se determinaron mediante un kit ELISA de Anrc (Tianjin, China).

El procedimiento de inmunohistoquímica (IHC) se realizó como se describe en otra parte. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos contra HDGF o Ki-67. Un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de Jackson (West Grove, PA) se diluyó en PBS. La unión específica se visualizó con el sustrato de peroxidasa diaminobencidina (DAB) de Pierce (Rockford, IL).

Los datos se presentan como medias ± DE. Para los estudios in vitro, los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Para los estudios in vivo, se incluyeron 5 ratones en cada grupo. Los datos que se encontraban fuera de los rangos de las medias ± 3 × DEs fueron excluidos siguiendo los criterios preestablecidos. Los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos en GraphPad Prism 6.0. Se realizó la prueba U de Mann‒Whitney para comparar la expresión génica entre diferentes grupos, y otras comparaciones se realizaron mediante la prueba t de Student. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Las variaciones de los datos se compararon mediante pruebas F. Se usó la prueba de Mann Whitney para comparar los datos cuando el valor p de las pruebas F es menor que 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, Moecks J, Keil L, Mok T, et al. Resultados clínicos en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas con mutaciones de EGFR: análisis agrupado. J Célula Mol Med. 2010;14:51–69.