Redirección universal de células CAR T contra tumores sólidos a través de membrana

Dec 21, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

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La eficacia de las terapias de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) para tumores sólidos se ve obstaculizada por las dificultades en la selección de un antígeno diana eficaz, debido a la expresión heterogénea de los antígenos tumorales y a la expresión del antígeno diana en tejidos sanos. Aquí mostramos que las células T con un CAR específico para el isotiocianato de fluoresceína (FITC) pueden dirigirse contra tumores sólidos a través de la administración intratumoral de un anfífilo de lípido-poli(etileno)-glicol conjugado con FITC que se inserta en las membranas celulares. En xenoinjertos de tumores singénicos y humanos en ratones, el "marcado anfífilo" de las células tumorales condujo a la regresión del tumor a través de la proliferación y acumulación de células CAR T específicas de FITC en los tumores. En los tumores singénicos, la terapia indujo la infiltración de las células T del huésped, provocó la sensibilización de las células T endógenas específicas del tumor y condujo a la actividad contra los tumores distales no tratados y a la protección contra la reexposición del tumor. Los ligandos de inserción de membrana para CAR específicos pueden facilitar el desarrollo de terapias celulares adoptivas que funcionan independientemente de la expresión del antígeno y del tejido de origen.

La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ha logrado el éxito clínico en el tratamiento de múltiples neoplasias malignas hematológicas1,2,3, incluido el mieloma múltiple más reciente4; sin embargo, su traducción a tumores sólidos ha sido un desafío5,6,7. Uno de los principales desafíos que presentan los tumores sólidos es la selección del antígeno diana. Los CAR actuales se dirigen a autoantígenos sobreexpresados ​​o proteínas de superficie celular mutadas expresadas por células cancerosas; sin embargo, la selección de antígenos para atacar tumores sólidos a menudo es problemática. Por un lado, los antígenos asociados a tumores, como el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) o la mesotelina, a menudo también se expresan en tejidos sanos, lo que lleva a toxicidades fuera del tumor en el objetivo8,9,10. Por otro lado, la expresión de proteínas de la superficie celular mutadas, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico III (EGFRvIII), está restringida a las células cancerosas, pero dichos neoantígenos a menudo se expresan de manera heterogénea, lo que aumenta la probabilidad de resistencia y/o crecimiento de antígenos. células cancerosas negativas 11. Por lo tanto, existe una gran necesidad de identificar antígenos tumorales más óptimos o de desarrollar estrategias alternativas para dirigir las células CAR T contra tumores sólidos. Los ejemplos de avances recientes incluyen la optimización de los diseños de CAR para mejorar el reconocimiento de células tumorales con bajo contenido de antígenos12,13, CAR multiespecíficos que reconocen más de un antígeno13,14,15 y circuitos genéticos que permiten la lógica de detección de antígenos (como synNotch circuitos para limitar la expresión de CAR al tumor16,17,18,19). Sin embargo, estos enfoques combinatorios se vuelven intrínsecamente más complejos con cada antígeno adicional, y comprender cómo se deben ajustar dichos circuitos genéticos de células T con CAR para que sean seguros y efectivos frente a los niveles variados de antígenos en los pacientes sigue siendo un problema traslacional complejo.

Un mecanismo inmunológico mediante el cual la terapia con células CAR T puede combatir la heterogeneidad antigénica del tumor y la pérdida de antígenos es a través del fenómeno de la propagación del antígeno (o propagación del epítopo), mediante el cual la destrucción de las células cancerosas por las células CAR T promueve la liberación de antígenos tumorales de forma proinflamatoria favorable. microambiente, lo que lleva al cebado de respuestas de células T endógenas de novo dirigidas a antígenos adicionales en el tumor20. Se ha observado evidencia de propagación del epítopo en estudios preclínicos murinos que incluyen células T CAR EGFRvIII en glioma murino21,22, células T CAR T de la subunidad alfa 2 del receptor de interleucina 13 (IL-13Ra2) en glioblastoma multiforme murino23 y células T CAR CD19 dirigidas a tumores sólidos inducidos para expresar CD19 (ref. 24). Para mejorar la propagación del antígeno, las células T transgénicas con receptor de células T y las células T con CAR se han diseñado para secretar ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS (Flt3L) para expandir las células dendríticas (DC) de presentación cruzada, que son fundamentales para este proceso25.

Otro enfoque del problema de la selección de antígenos en tumores sólidos ha sido inducir terapéuticamente antígenos exógenos en células tumorales para permitir la selección de células T con CAR. Por ejemplo, se han utilizado vectores virales de terapia génica o virus oncolíticos para transducir células tumorales con antígenos extraños arbitrarios o antígenos con un perfil de efectos secundarios conocidos en la terapia con células CAR T (como CD19) (refs. 24, 26, 27) . Este es un enfoque atractivo porque los antígenos se pueden seleccionar sin preocuparse por la selección cruzada de tejidos sanos, y la inducción de la propagación del antígeno por el ataque de las células T con CAR en los tumores transducidos promueve respuestas de células T endógenas que limitan el escape de la pérdida de antígenos y proporcionan antitumorales sistémicos. inmunidad24,27. Sin embargo, una limitación traslacional de la introducción de antígenos extraños a través de virus modificados es la heterogeneidad y la transducción altamente variable que logran los vectores virales tanto dentro de los tumores individuales como entre los tumores de un paciente a otro28,29,30.

Hemos estudiado ampliamente el comportamiento de las moléculas anfifílicas compuestas por compuestos terapéuticos conjugados con poli(etilenglicol) (PEG)-lípidos anfifílicos. Estos conjugados de 'anf-ligando' exhiben varias propiedades útiles para controlar la farmacocinética y la biodistribución de cargas útiles terapéuticas vinculadas, como péptidos, proteínas o moléculas pequeñas31,32,33. Por ejemplo, los ligandos anf pueden insertar sus colas lipídicas en la membrana plasmática de las células in vitro e in vivo sin toxicidad, lo que conduce a la exhibición en la superficie celular de los compuestos unidos21,31. Después de la inyección parenteral, los ligandos anf también se transportan de manera eficiente hacia los ganglios linfáticos de drenaje (LN) y decoran las superficies de las células presentadoras de antígeno (APC)21. Anteriormente explotamos esta química física para decorar las APC de LN con ligandos para las células T con CAR, lo que creó un efecto vacunal en el drenaje de las LN que mejoró la proliferación, la función y la eficacia de las células T con CAR21.

En este artículo, informamos una estrategia para emplear ligandos anf como un medio para redirigir las células CAR T contra cualquier tumor sólido. Mostramos que un conjugado anfífilo de la molécula pequeña de isotiocianato de fluoresceína (FITC) agregado a las células cancerosas in vitro conduce a la decoración de la membrana plasmática de las células tumorales, lo que permite el reconocimiento por parte de las células CAR T que tienen receptores quiméricos específicos de FITC y desencadena la activación de las células CAR T. proliferación y muerte de las células diana decoradas con amph-FITC. In vivo, la inyección intratumoral (it) de amph-FITC seguida de una infusión sistémica de células CAR T específicas de FITC conduce a la activación y acumulación de células CAR T en los tumores, acompañada de regresión tumoral en modelos de tumores sólidos de xenoinjerto murino y humano. La actividad de los linfocitos T con CAR estimulada por Amph-FITC también desencadenó el cebado de una respuesta endógena de linfocitos T específica de un tumor, lo que indujo respuestas "abscopales" contra tumores distales no tratados y memoria inmunitaria contra el nuevo desafío del tumor. Por lo tanto, las células CAR T dirigidas por amph-FITC pueden proporcionar un enfoque para la regresión tumoral segura y eficaz y para la inmunidad antitumoral sistémica que se puede aplicar a cualquier tumor sólido, independientemente del tejido de origen o el genotipo maligno.

Imaginamos que las propiedades de inserción de membrana de los conjugados PEG-lípidos podrían usarse para decorar las células tumorales con ligandos para un CAR, 'pintando' el tumor para que sea reconocido por las células CAR T. En este contexto, la elección del ligando de las células T con CAR es arbitraria, y elegimos utilizar FITC como un compuesto no inmunogénico seguro para redirigir las células T con CAR contra los tumores. Presumimos que la administración de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-PEG-FITC (DSPE-PEG-FITC, o amph-FITC) permitiría el reconocimiento y destrucción de células tumorales por parte de las células CAR T específicas de FITC. (Figura 1a).

a, Esquema de la estructura de amph-FITC, inserción en las membranas de las células cancerosas y reconocimiento por parte de las células T con CAR de FITC. Creado con Biorender.com. b,c, se incubaron células de melanoma murino B16F10 con amph-FITC a las concentraciones indicadas durante 30 min a 37 °C en PBS, se tiñeron con un anticuerpo anti-FITC y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran histogramas representativos de FITC total (b) y señales anti-FITC (c). d, las células B16F10 se incubaron con conjugados amph-FITC de PM de PEG variable como en b en las concentraciones indicadas y luego se tiñeron con anti-FITC para el análisis de citometría de flujo. Se muestran las intensidades de fluorescencia medianas (MFI) de las señales FITC (izquierda) y anti-FITC (derecha). e, Análisis cinético de MFI anti-FITC de B16F10 cultivada en RPMI después del marcado en amph-FITC 100 nM. f, Histogramas de células de cáncer de colon MC38 marcadas con concentraciones tituladas de amph-FITC para producir la misma fluorescencia de FITC por célula (arriba). Posteriormente, las células cancerosas se cultivaron con células T CAR 4m5.3-28z en una relación E:T de 1:1. g,h, cultivo conjunto de células T CAR E2-m28z específicas de FITC o células T no transducidas de control con células cancerosas B16F10 (g) o CT-2A (h) con o sin recubrimiento por 100 nM amph-FITC en un rango de Relaciones E:T. Se muestran la media ± sd de muestras duplicadas (todas las réplicas biológicas). Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías. NS, no significativo; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Datos fuente

Primero evaluamos el etiquetado de células cancerosas in vitro mediante la incubación de amph-FITC con células de melanoma murino B16F10 durante 30 min a 37 °C. El análisis de citometría de flujo de las células de melanoma reveló una asociación dependiente de la dosis de amph-FITC con las células (Fig. 1b), y FITC se expuso en las superficies celulares como lo reveló la tinción posterior de las células recubiertas de amph-FITC con un anti-FITC. anticuerpo (Fig. 1c). De manera similar, amph-FITC también podría asociarse y exponerse en las superficies de células de carcinoma de colon murino MC38 y células de glioblastoma murino CT-2A (Figura complementaria 1a, b). Se sabe que la ubicación física de los epítopos de CAR en los antígenos diana (más cerca o más lejos de la membrana celular) afecta la señalización del receptor quimérico y la activación de CAR T34,35. Además, hemos demostrado previamente que la longitud de la cadena de polímero en los anfífilos PEG-DSPE afecta la inserción de la membrana32. Para determinar cómo la longitud del enlazador de PEG de amph-FITC afecta la inserción de la membrana y la estabilidad del marcaje, incubamos células B16F10 con moléculas de amph-FITC compuestas de un rango de pesos moleculares (MW) de PEG y medimos la superficie celular y asociada a células total resultante. -FITC expuesto en un rango de concentraciones (Fig. 1d), luego lavó las células en medio fresco y rastreó la pérdida de señal de FITC durante 48 h (Fig. 1e y Fig. 1c complementaria). DSPE-PEG2k-FITC logró la inserción más alta a bajas concentraciones y exhibió la mayor persistencia, con un etiquetado sustancial aún detectable después de 24 h en medio fresco.

A continuación, probamos el reconocimiento de células CAR T de células B16 decoradas con moléculas amph-FITC. Los linfocitos T CAR específicos de FITC se generaron mediante la transducción de linfocitos T CD8+ murinos primarios con un CAR compuesto por los fragmentos variables monocatenarios (scFvs) específicos de FITC 4m5.3 (ref. 36) o E2 (ref. 37) fusionados a un Bisagra de CD8, dominio transmembrana de CD8, dominio coestimulador de CD28 y dominio de señalización de CD3ζ similar a nuestros diseños informados anteriormente21 (abreviados de ahora en adelante como CAR 4m5.3-28z y E2-28z, Fig. 2a-d complementaria). Para evaluar cómo la longitud del conector PEG influye en la capacidad de las células CAR T específicas de FITC para reconocer las células diana decoradas con amph-FITC, incubamos células de cáncer de colon MC38 con amph-FITC de PM variable en concentraciones tituladas para dar el mismo número medio de FITC moléculas por célula (Fig. 1f, arriba), y luego se agregaron 4m5.3-28z de células CAR T a las células tumorales marcadas en un rango de proporciones de efector: objetivo (E: T). DSPE-PEG2k-FITC y DSPE-PEG3.4k-FITC provocaron una activación robusta de células CAR T según lo leído por la secreción de interferón gamma (IFN-γ), mientras que el DSPE-PEG1k-FITC de PM más bajo fue mucho menos efectivo (Fig. 1f, abajo). En función de su inserción óptima en la membrana celular y las propiedades de estimulación de CAR T, nos centramos en DSPE-PEG2k-FITC para realizar más estudios. El etiquetado DSPE-PEG2k-FITC desencadenó la activación de las células T con CAR E2-28z acompañada de la secreción de citoquinas y la destrucción eficiente de las células B16F10 y las células de glioma murino CT-2A por las células T con CAR de FITC (Fig. 1g, h). Por lo tanto, con esta molécula óptima de amph-FITC, se pueden marcar diversas células cancerosas para activar eficazmente las células T con CAR y eliminar las células diana.

A continuación, evaluamos el etiquetado del tumor in vivo después de la inyección de amph-FITC, usando una dosis de amph-FITC (10 nmol) que previamente encontramos que era eficaz para estimular las células CAR T21. Después de una sola inyección en tumores B16F10 establecidos, amph-FITC marcó grandes regiones del tumor según lo revelado por la histología (Fig. 2a). Para evaluar la fuga potencial de amph-FITC fuera del tumor hacia el tejido sano circundante, analizamos las secciones del tumor y el tejido no tumoral adyacente mediante inmunohistoquímica. Si bien las inyecciones provocaron la acumulación de amph-FITC cerca de los bordes de los tumores en algunos casos, observamos una captación muy escasa de amph-FITC en las células del tejido vecino (Fig. 2b). La cuantificación del FITC extraído del tumor, los ganglios linfáticos que drenan el tumor (TDLN) y otros tejidos distales 24 h después de la inyección reveló que el amph-FITC permaneció confinado en gran medida al tumor y al drenaje de los LN inguinales y axilares (Fig. 2c). Presumimos que la captación de amph-FITC en los LN que drenan podría apoyar la proliferación y función de las células T con CAR al decorar las APC residentes en LN, como se describió en nuestros estudios anteriores que emplearon amph-FITC como vacuna para las células T con CAR21.

Se inocularon ratones C57BL/6 con 106 tumores B16F10 en el flanco, seguido de una inyección de 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 25 mm2. a, Microscopía confocal de tumores B16F10 24 h después de la inyección de amph-FITC. Se muestra una imagen histológica representativa de dos tumores analizados. b, Se inocularon un total de 106 células B16F10 en ratones C57BL/6 (n = 4 por grupo) y se inyectaron intratumoralmente con 10 nmol de amph-FITC cuando los tumores tenían un tamaño de ~25 mm2. Dos horas después, los tumores se aislaron con tejido conjuntivo vecino, se crioseccionaron y se tiñeron con anticuerpo anti-Trp1 para identificar células de melanoma, anti-FITC y una tinción de membrana celular. Se muestran secciones representativas de un control de PBS y dos tumores inyectados con amph-FITC. Barras de escala, 200 μm. c, Biodistribución de amph-FITC 24 h después de su inyección en tumores B16F10 (n = 5 animales por grupo). d, Gráficos representativos de citometría de flujo de tumores B16 inyectados con amph-FITC (controlados en células CD45−) teñidos con anti-FITC para detectar antígeno expuesto en la superficie. e, Inmunofenotipificación de tumores B16F10 en ratones sin LD previa a 1, 24 y 48 h después de la inyección de amph-FITC, cuantificando la proporción de células FITC+ anti-FITC+ doble positivas (izquierda) y la densidad de células FITC+ anti-FITC+ en el tumor (derecha) (n = 5 animales por grupo). Todas las réplicas son réplicas biológicas. Los valores de p se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney ( d ) o la prueba t de Student no pareada ( e ). Se muestran la media ± sd NS, no significativa; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Datos fuente

El análisis de citometría de flujo mostró que FITC fue absorbido por una gran proporción de células tumorales 24 h después de la inyección y permaneció accesible en las superficies celulares detectadas mediante tinción con un anticuerpo anti-FITC (Fig. 2d). Como era de esperar, entre los muchos tipos de células dentro del tumor, tanto las células cancerosas como las células huésped (es decir, las células mieloides infiltrantes y las células T) se etiquetaron con FITC (Fig. 2e y Fig. 3a complementaria), con ~ 40–60% de cada tipo de célula con FITC expuesto extracelularmente después de 1 h, y entre el 20% y el 40% de las células que aún tienen FITC expuesto a las 24 h (Fig. 2e, izquierda y Fig. 4 complementaria). Sin embargo, debido a su abundancia relativa, numéricamente a las 24 h, la gran mayoría de las células decoradas en la superficie con FITC eran células cancerosas (Fig. 2e, derecha). Dado que el agotamiento de linfocitos (LD) comúnmente utilizado para promover el injerto de células CAR T podría afectar la captación de amph-FITC, también llevamos a cabo un análisis de la distribución celular de FITC en animales que recibieron LD mediante irradiación corporal total (TBI) de 5 Gy 24 h antes de la inyección de amph-FITC . El pretratamiento con LD redujo sustancialmente las células inmunitarias y favoreció el etiquetado de células cancerosas en una proporción aún mayor (Figs. 3b, c y 4 complementarias). En conjunto, estos datos indican que su administración restringe efectivamente la disponibilidad de amph-FITC para el tumor y las TDLN, lo que lleva a un marcado FITC sólido en la superficie de las células cancerosas.

A continuación, caracterizamos la capacidad de las células T con CAR específicas de FITC para reconocer tumores inyectados con amph-FITC, y rastreamos la expansión de las células T con CAR y la localización del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia. Los ratones que tenían tumores B16F10 fueron linfodeplecionados por TBI, seguido de transferencia adoptiva de células T CAR E2-28z que expresan luciferasa de luciérnaga. Comenzando 2 días después, se administró amph-FITC por vía intratumoral y cada 3 días a partir de entonces para volver a marcar las células tumorales que aún no habían sido eliminadas por las células CAR T (Fig. 3a, CAR T + IT FITC). Elegimos administrar la primera dosis de amph-FITC después de la administración de CAR T para maximizar el tiempo que tardan las células CAR T en encontrar células tumorales decoradas con un alto nivel del ligando FITC. Para respaldar aún más el ataque de las células CAR T en los tumores pintados con FITC, en un grupo separado también probamos el efecto de la transferencia de células CAR T (± it amph-FITC) combinado con una inyección subcutánea bilateral una vez por semana de amph-FITC junto con el estimulador de genes de interferón (STING) agonista cíclico-di-GMP adyuvante como refuerzo de vacuna. Esta inyección se dirige a mph-FITC a las DC en el drenaje de los LN y actúa como una vacuna para las células CAR T, lo que desencadena la expansión de las células CAR T y una mayor funcionalidad, como informamos anteriormente21. Las imágenes de bioluminiscencia de células CAR T transferidas a ratones en ausencia de tratamiento con amph-FITC revelaron un bajo grado de expansión de células CAR T E2-28z durante 14 días sin infiltración sustancial de tumores (Fig. 3b, c). La administración de la vacuna amph-FITC o amph-FITC desencadenó individualmente la expansión de células CAR T, pero la vacunación con amph-FITC sola desencadenó una acumulación más prominente de células CAR T cerca del sitio de inyección de la vacuna cerca de la base de la cola en lugar del tumor. Por el contrario, amph-FITC condujo a una expansión total comparable de células CAR T durante los primeros 7 días, pero a una mayor acumulación en el sitio del tumor (Fig. 3b, c). La adición del refuerzo de la vacuna al tratamiento con amph-FITC no tuvo un impacto notable en la expansión o acumulación general de células T en el sitio del tumor. Repetimos este experimento tratando tumores CT-2A, y el análisis de los tumores tratados en el día 12 reveló una infiltración sustancial de células T en todo el tumor (muy probablemente por células CAR T debido a la proximidad temporal a LD) (Fig. 3d, e). También analizamos la infiltración de células T con CAR E2-28z de carcinomas de colon MC38 y encontramos aumentos en la abundancia de células T con CAR tanto en la sangre periférica como en el tumor después del tratamiento con amph-FITC (datos extendidos Fig. 1a-c). Por lo tanto, el tratamiento con amph-FITC con y sin vacunación de apoyo con amph-FITC conduce a una expansión significativa de la población de células T con CAR y la infiltración de tumores por células T con CAR E2-28z.

a, Esquema y cronología de la terapia en tumores B16F10, incluida la vacuna de refuerzo CAR T. Creado con Biorender.com. b,c, Localización de células T FLuc+ E2-m28z FITC CAR en ratones con tumor B16F10 en el día 8 (b) y cuantificación de la radiación del ratón completo (arriba) y del tumor (abajo) (c) (n = 5 animales por grupo , réplicas biológicas). El círculo blanco discontinuo indica la ubicación del tumor en el flanco. d, inmunohistoquímica representativa en tumores CT-2A tratados con la vacuna amph-FITC ± amph-FITC, tinción para CD8, en el día 12 después de la transferencia adoptiva. Barra de escala, 50 µm. e, Cuantificación de células T CD8+ por mm2 por campo de visión (FOV) en 10 FOV por tumor, n = 10 FOV por condición. Las réplicas son réplicas técnicas para capturar la infiltración de células T en muchos FOV dentro del tumor. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. Las barras de error representan el error estándar de la media (c) y sd (e). NS, no significativo; ****P < 0,0001.

Datos fuente

Luego evaluamos el impacto terapéutico de la transferencia de células CAR T dirigidas a FITC combinada con la vacunación con amph-FITC y amph-FITC en los modelos tumorales B16F10 y CT-2A, siguiendo el esquema de líneas de tiempo experimentales en la Fig. 3a y la Fig. 4a, respectivamente. . Primero probamos el tratamiento del modelo B16F10 altamente agresivo y poco inmunogénico, y evaluamos el tratamiento con o sin la inclusión de refuerzo con la vacuna amph-FITC. Como se muestra en la Fig. 4b, las células T CAR E2-28z redirigidas por ella amph-FITC detuvieron la progresión del tumor durante ~ 2 semanas y prolongaron la supervivencia; la adición de refuerzo con la vacuna amph-FITC mostró una tendencia hacia una regresión tumoral ligeramente mejor y una extensión de la supervivencia, aumentando la mediana de supervivencia en 3 días. Para determinar si el método de LD afecta la respuesta a esta terapia, también probamos el tratamiento con el régimen de quimioterapia clínica LD de ciclofosfamida y fludarabina antes de la transferencia de células T con CAR, y observamos una actividad antitumoral similar (Datos ampliados Fig. 2a).

a, Esquema y línea de tiempo de la terapia para el tratamiento del tumor CT-2A. b, Crecimiento tumoral y supervivencia general de ratones C57BL/6 (n = 5 animales por grupo) que portan tumores B16F10 tratados con células T CAR E2-28z como en la Fig. 3a con las combinaciones indicadas. c, Crecimiento tumoral de ratones C57BL/6 con tumor CT-2A (n = 5 animales por grupo) tratados con linfocitos T amph-FITC, FITC CAR y vacuna compuesta solo de linfocitos T CD8+ o una combinación de linfocitos T CD4+ y CD8+ . d, Crecimiento tumoral y supervivencia después del tratamiento de ratones portadores de tumores CT-2A (n = 5 animales por grupo) con CAR con afinidades bajas (E2.7), medias (E2) y altas (4m5.3) por FITC, incluidos es amph-FITC y vacuna. e,f, Crecimiento tumoral (e) y supervivencia (f) de ratones portadores de tumores CT-2A tratados con CAR con dominios coestimuladores CD28 o 4-1BB en una variedad de afinidades de unión en combinación con IT amph-FITC y amph -Vacunación FITC (n = 5 animales por grupo). Las barras de error representan el error estándar de la media. Todas las réplicas son réplicas biológicas. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías (curvas de crecimiento tumoral) y prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) (curvas de supervivencia). NS, no significativo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Datos fuente

A continuación, recurrimos al modelo de tumor CT-2A, como un tumor de progresión lenta más susceptible al tratamiento con inmunoterapia, y tratamos de diseccionar los factores que rigen la eficacia terapéutica del tratamiento con FITC CAR T. Primero, probamos el efecto de la composición de CD4/CD8 en el producto de células CAR T. La transferencia adoptiva de células CAR T CD8+ E2-28z exclusivamente combinadas con amph-FITC y vacunación detuvo la progresión de los tumores CT-2A durante 3 semanas (Fig. 4c). Aunque LD solo retrasó la progresión del tumor (datos extendidos Fig. 2b), este efecto fue mucho más débil que la respuesta provocada al combinar la transferencia adoptiva con amph-FITC. Curiosamente, en contraste con la evidencia que respalda un papel importante para las células T CAR T CD4+ en modelos de ratón humanizados de mesotelioma o linfoma38,39, la transferencia de un número equivalente de células T CAR T murinas preparadas con una proporción ~1:1 CD8+:CD4+ fue sustancialmente menor efectivo (Fig. 4c).

Dada la gran cantidad de literatura que sugiere efectos importantes de la afinidad CAR y la selección del dominio coestimulador en el resultado de la terapia CAR T tradicional40,41,42,43,44,45,46,47,48,49, a continuación evaluamos el impacto de estos parámetros de diseño CAR sobre la eficacia del tratamiento CAR T redirigido por amph-FITC. Para modular la afinidad de CAR, comparamos la eficacia de las células CAR T que portan el scFv específico de E2 FITC (KD = 2,4 nM) con las CAR preparadas a partir de un scFv de FITC de muy alta afinidad, 4m5,3 (KD = 300 fM), o el scFv E2.7 de menor afinidad (KD = 8,9 nM), que difiere del E2 de tipo salvaje (WT) por una única sustitución de aminoácido. Cada uno de estos tres CAR variantes de scFv se preparó con un dominio coestimulador CD28 o miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral 9 (TNFSF9, en lo sucesivo denominado 4-1BB) para interrogar aún más el papel de la señalización coestimuladora. Como se muestra en la Fig. 5 complementaria, las células T CD8+ murinas mostraron una transducción y expresión eficientes de cada uno de estos CAR, aunque los CAR basados ​​en CD28 se expresaron a niveles ~ 10 veces más altos que los CAR 4-1BB. Junto con la vacuna amph-FITC + FITC, todas estas células T con CAR específicas para FITC mostraron niveles similares de eficacia terapéutica en el tratamiento de tumores C2TA y en la extensión de la supervivencia de los animales, con la excepción de la CAR E2.7-BBz que fue ligeramente menor efectivo (Fig. 4d-f). Sin embargo, los CAR con dominios coestimuladores CD28 demostraron un control del crecimiento tumoral más temprano en comparación con aquellos con dominios coestimuladores 4-1BB, independientemente de la afinidad del scFv (Fig. 4e). El CAR E2-28z más eficaz provocó respuestas completas en el 40 % de los animales. Optamos por centrarnos en este CAR para estudios posteriores, en función de su eficacia terapéutica y expresión superior.

Finalmente llevamos a cabo experimentos con el objetivo de optimizar la dosificación de amph-FITC y la preparación de células CAR T de máxima eficacia en este paradigma de tratamiento. Primero evaluamos la importancia de la frecuencia de la dosificación, ya que la dosificación cada pocos días durante varias semanas solo puede ser clínicamente factible para lesiones superficiales en enfermedades como el melanoma o el cáncer de cabeza y cuello. Curiosamente, reducir la frecuencia de las inyecciones a una vez cada 6 días no redujo el efecto terapéutico (Datos ampliados, Fig. 3a). Finalmente, también se sabe que el cultivo ex vivo de células CAR T en IL-7 e IL-15 en lugar de la IL-2 tradicional favorece el fenotipo de memoria central (TCM) y aumenta el control del tumor50,51,52. Sin embargo, las células FITC CAR T se expandieron en IL-7 e IL-15 en lugar de IL-2 y no demostraron un mejor control del tumor (Datos ampliados, Fig. 3b). Por lo tanto, finalizamos nuestra terapia para usar células T CAR E2-28z expandidas en IL-2 para estudios adicionales.

Una preocupación principal con la administración química de un ligando CAR T es el potencial de diseminación de amph-FITC para desencadenar el ataque de células CAR T en tejidos sanos. Descubrimos que la administración local de amph-FITC marca mínimamente los tejidos normales (Fig. 2b), y no detectamos una inflamación obvia de la piel que rodea los tumores tratados durante el tratamiento, lo que sugiere que la actividad de las células CAR T permanece principalmente en ella. Sin embargo, el hallazgo que las células T con CAR E2-28z se expandieron en la sangre periférica después de su tratamiento con amph-FITC (datos extendidos, figura 1b) nos llevó a evaluar las posibles toxicidades sistémicas. En los estudios de terapia, los ratones que recibieron células CAR T junto con la vacunación con amph-FITC y FITC no mostraron pérdida de peso y ganaron masa con el tiempo indistinguible de los animales de control no tratados (Datos extendidos, Fig. 4a, b). Medimos las citoquinas séricas 24 h después de la inyección de amph-FITC el día 3 y el día 12 después de la transferencia de células T con CAR E2-28z en el modelo de tumor CT-2A, y no observamos aumento de las citoquinas inflamatorias, con la excepción de un nivel bajo de IFN -γ en el día 3 (Datos extendidos Fig. 4c). Tampoco pudimos detectar la elevación de las enzimas hepáticas alanina transaminasa (ALT) o aspartato transaminasa (AST) en los puntos de tiempo correspondientes, lo que indica una falta de toxicidad hepática (Datos extendidos Fig. 4d). Por lo tanto, la terapia con linfocitos T CAR específicos de FITC y amph-FITC parece ser segura y bien tolerada.

Planteamos la hipótesis de que al redirigir las células T con CAR contra las lesiones inyectadas, los antígenos tumorales podrían liberarse en un microambiente proinflamatorio favorable que impulsaría el cebado de las células T endógenas y la inducción de una respuesta inmunitaria antitumoral sistémica. Aunque empleamos TBI para promover el injerto de células CAR T al comienzo del tratamiento, se sabe que los linfocitos se recuperan rápidamente después de LD53, y otros estudios han informado evidencia de respuestas inmunitarias endógenas preparadas por la terapia de células CAR T a pesar del uso de regímenes de reducción de linfocitos21,25 . En primer lugar, evaluamos la infiltración de células T CD45.2+ CD4+ y CD8+ del huésped en tumores CT-2A tratados con linfocitos T CAR amph-FITC y CD45.1+. Mientras que los tumores no tratados mostraron niveles muy bajos de linfocitos infiltrantes de tumores, el tratamiento con amph-FITC/CAR T provocó una fuerte infiltración de células T huésped CD45.2+ (Fig. 5a). Para evaluar la inducción potencial de la memoria de células T endógenas mediante el tratamiento con amph-FITC/CAR T, volvimos a desafiar a ratones que habían rechazado tumores CT-2A en respuesta a la terapia con amph-FITC/E2-28z CAR T con células tumorales en el flanco opuesto. Mientras que los ratones ingenuos de control inoculados con células CT-2A mostraron una progresión tumoral constante, todos los ratones curados por el tratamiento con amph-FITC/CAR T rechazaron la nueva provocación, a pesar de la ausencia de FITC en el nuevo tumor (Fig. 5b), lo que sugiere la inducción de memoria de células T endógenas protectoras.

a, Citometría de flujo en tumores CT-2A tratados el día 34 después de la transferencia adoptiva de células T CD45.2+ FITC CAR, cuantificación de células T huésped infiltrantes de tumor CD4+ frente a CD8+ CD45.1+ (n = 4 animales por grupo). b, los ratones portadores de tumores CT-2A previamente curados con terapia CAR T y amph-FITC se volvieron a exponer frente a ratones ingenuos con 106 células cancerosas CT-2A en el flanco opuesto el día 92 después de la transferencia adoptiva (n = 5 animales por grupo). c, d, Gráficos de flujo representativos de DC (c) en tumores y TDLN de ratones con tumores tdTomato+ CT-2A a los 12 días posteriores a la transferencia y cuantificación adoptiva (d) de tdTomato+ DC en TDLN (n = 3 animales por grupo sin grupo CAR T, n = 4 para CAR T + it grupo FITC). e,f, Expresión de los marcadores de activación CD86 (e) y CCR7 (f) en DC TDLN a los 12 días posteriores a la transferencia adoptiva con histogramas representativos (n = 3 animales por grupo para el grupo sin CAR T, n = 5 para CAR T + es grupo FITC). g, ELISPOT en bazos de ratones portadores de tumores CT-2A el día 37 después de la transferencia adoptiva (n = 5 animales por grupo). Los esplenocitos se estimularon con células cancerosas CT-2A irradiadas. Todas las réplicas son réplicas biológicas. Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Las barras de error representan sd NS, no significativo; *P < 0,05, **P < 0,01.

Datos fuente

Un paso clave para la preparación de las respuestas de células T endógenas es la adquisición del antígeno tumoral por parte de las células dendríticas (DC). Para determinar si la terapia con amph-FITC/CAR T promovía la captación de DC de los restos de células tumorales, tratamos tumores tdTomato+ CT-2A y descubrimos que las células inmunitarias, más notablemente las DC tanto en el tumor como en el LN que drena el tumor, se convirtieron en tdTomato+, lo que sugiere la captación de antígenos tumorales (Fig. 5c, d). Además, más DC en el TDLN expresaron marcadores de activación CD86 y CCR7 (Fig. 5e, f). Por lo tanto, la redirección de las células CAR T contra los tumores a través de la decoración de amph-FITC promueve la entrega de antígenos y la activación de las APC profesionales que gobiernan el cebado de las células T endógenas. Por último, analizamos directamente el desarrollo de células T endógenas específicas del tumor después del tratamiento con células T CAR amph-FITC/E2-28z mediante la reestimulación de esplenocitos de ratones tratados con amph-FITC/CAR T ex vivo con células tumorales CT-2A irradiadas. Como se muestra en la Fig. 5g, la reestimulación de esplenocitos de animales tratados con células CT-2A confirmó que el tratamiento con amph-FITC/CAR T amplificó las respuestas de células T endógenas específicas del tumor en relación con los ratones portadores de tumores no tratados, aunque se agregó la vacuna amph-FITC. el refuerzo no pareció proporcionar un beneficio adicional en comparación con la administración de amph-FITC sola.

Alentados por la evidencia de que el tratamiento con amph-FITC/CAR T provoca el cebado de células T endógenas, evaluamos a continuación si esta terapia localizada podría desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales sistémicas. Con este fin, implantamos tumores CT-2A bilateralmente en los flancos de ratones y tratamos solo el tumor del flanco derecho mediante la administración de amph-FITC (en combinación con vacunación con amph-FITC, Fig. 6a). Sorprendentemente, tanto los tumores inyectados (1 °) como los no inyectados (2 °) mostraron una progresión sustancialmente más lenta, y la supervivencia general de los animales tratados mejoró significativamente (Fig. 6b, c). Luego probamos la capacidad de la administración local de amph-FITC para provocar inmunidad sistémica contra los melanomas B16F10; para este modelo más agresivo, el tumor secundario no inyectado se inoculó varios días después del tumor primario a tratar, para permitir que se desarrollara el tiempo de respuesta de las células T endógenas antes del crecimiento rampante del tumor distal (Fig. 6d). La inyección de solo el tumor primario condujo a un crecimiento más lento del tumor tratado y una tendencia hacia una progresión más lenta de las lesiones no tratadas, además de aumentos significativos en la supervivencia general sobre los animales no tratados (Fig. 6e,f). Por lo tanto, la respuesta de células T endógenas iniciada por la redirección local de células CAR T con inyección de amph-FITC conduce al ataque inmunitario de tumores distales no tratados.

a–c, ratones C57BL/6 (sin tratar n = 10, tratados n = 8) se inocularon con células tumorales CT-2A en los flancos opuestos, luego se trataron con células T FITC-CAR, vacunación con amph-FITC y solo con amph-FITC en la 1° lesión. Se muestran la línea de tiempo y el esquema del tratamiento (a), el tamaño medio del tumor (b) y la supervivencia general (c) a lo largo del tiempo. Creado con Biorender.com. d–f, ratones C57BL/6 (n = 10 por grupo) fueron inoculados con células tumorales B16F10 en flancos opuestos, luego tratados con células T FITC-CAR, vacunación con amph-FITC y amph-FITC solo en la 1° lesión. Se muestran la línea de tiempo del tratamiento (d), el tamaño medio del tumor (e) y la supervivencia general (f) a lo largo del tiempo. Las barras de error representan el error estándar de la media. Todas las réplicas son réplicas biológicas. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías (curvas de crecimiento tumoral) y prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) (curvas de supervivencia). NS, no significativo; **P < 0,01; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Datos fuente

Centramos nuestros estudios iniciales en modelos de ratones inmunocompetentes utilizando células T con CAR murinas para permitir el análisis de la propagación de antígenos y la inmunidad de las células T endógenas, pero también fue importante evaluar la capacidad del etiquetado amph-FITC para redirigir eficazmente las células T con CAR humanas contra las células cancerosas humanas. . Con este fin, diseñamos CAR específicos de FITC que se expresaron altamente en células T humanas (Fig. 7a). In vitro, las células CAR T humanas preparadas con CAR basadas en 4m5.3 de alta afinidad o E2 scFv de menor afinidad exhibieron una potente citotoxicidad contra las células tumorales de mesotelioma humano MSTO-211H marcadas con amph-FITC, independientemente del uso de CD28 o 4. -Dominios coestimuladores de 1BB (datos extendidos Fig. 5a). Por lo tanto, las células T con CAR humanas también reconocen eficazmente las células cancerosas recubiertas de amph-FITC.

a, Expresión de FITC CAR humanizados. b, Esquema y línea de tiempo de la terapia en ratones NSG. Creado con Biorender.com. c, d, imágenes de bioluminiscencia ( c ) y cuantificación ( d ) del tráfico de células T CAR FLuc + en ratones NSG (n = 5 animales por grupo). e, crecimiento tumoral MSTO-211H de ratones NSG después del tratamiento con células T CAR E2-hBBz (n = 10 animales por grupo). Todas las réplicas eran réplicas biológicas. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías. Las barras de error representan el error estándar de la media. **P < 0,01; *** P < 0,001. NS, no significativo.

Datos fuente

En la mayoría de nuestros estudios de tratamiento de tumores murinos singénicos, lo administramos amph-FITC junto con amph-FITC administrado por vía subcutánea (sc) (con adyuvante) que se absorbe de manera eficiente en el drenaje de LN como refuerzo de vacuna21. Sin embargo, debido a que los vasos linfáticos y los LN periféricos son defectuosos en los ratones inmunodeficientes NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) utilizados para la evaluación de células T con CAR humanas54, nos limitamos a estimular las células T con CAR específicas de FITC a través de amph-FITC. Para probar la actividad in vivo de las células CAR T que responden a tumores recubiertos con amph-FITC, inoculamos tumores MSTO-211H en ratones NSG, transferimos de forma adoptiva células T CAR T 4m5.3 o E2 que expresan luciferasa con CD28 o 4-1BB co- dominios estimulantes 7 días después, y luego trató a los animales con dosis repetidas de amph-FITC (Fig. 7b). En contraste con las células T con CAR murinas, donde la transferencia de una población de células T con CAR T CD8+ puras tuvo una eficacia terapéutica superior a una población mixta de células T con CAR T CD4+ y CD8+, encontramos que las células T con CAR humanas proliferaron de manera más robusta como una población mixta de células CD4+ y CD8+. después de la administración de amph-FITC (datos extendidos, Fig. 5b), en consonancia con estudios previos38,39. Por lo tanto, procedimos con una población mixta de CD4/CD8 para experimentos con células T humanas. El análisis de las células CAR T después de la transferencia adoptiva mostró que estas células CAR T humanas estaban compuestas por una mezcla de memoria efectora (Tem) y células de memoria efectora que reexpresan fenotipos CD45RA (Temra) (Datos extendidos Fig. 5c, d).

Al tratar tumores como en la Fig. 7b, todas las células T con CAR mostraron algún nivel de acumulación en los tumores entre el día 13 y el día 25, pero las células T con CAR E2-h28z y E2-hBBz mostraron la mayor acumulación en los sitios del tumor inyectado ( Fig. 7c, d). La enumeración de células T con CAR en el bazo el día 40 también mostró la persistencia de todas las células T con CAR de manera sistémica, con la excepción de las células T con CAR de 4m5.3-h28z infundidas como una población CD8+ pura (Datos extendidos Fig. 5e). Debido a su mayor expresión, citotoxicidad tumoral in vitro superior y acumulación robusta en tumores, seguimos adelante con la construcción E2-hBBz CAR para estudios de terapia con células T humanas. En combinación con amph-FITC, las células T con CAR E2-hBBz condujeron al rechazo completo del tumor en aproximadamente el 20 % de los ratones y el crecimiento del tumor se detuvo en otro 60 % de la cohorte (Fig. 7e). No se observaron toxicidades evidentes en términos de pérdida de peso de los animales o alteraciones en el comportamiento durante el tratamiento hasta puntos de tiempo tardíos cuando los grupos tratados y no tratados comenzaron a mostrar síntomas de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), una limitación conocida del modelo de ratón NSG. En particular, la expansión relativa de 13,3 veces de las células CAR T inducida por el tratamiento con amph-FITC (datos extendidos, Fig. 5f) exacerbó la EICH en este grupo, lo que provocó la muerte prematura de varios animales que respondían al tratamiento (Fig. 7e). ). Por lo tanto, la inyección de amph-FITC parece una estrategia prometedora para redirigir las células T con CAR humanas contra los tumores sólidos.

Hasta ahora, la traducción de la terapia con células CAR T a tumores sólidos se ha visto limitada por la naturaleza imperfecta de los antígenos tumorales, con una expresión heterogénea de antígenos y poca especificidad tumoral que genera resistencia al tratamiento y toxicidad para los tejidos sanos, respectivamente8,9,10,11. Aquí describimos una terapia que emplea un conjugado de fosfolípido-polímero que, cuando se administra localmente a través de una inyección, marca las células dentro del tumor con un antígeno de molécula pequeña, FITC, y marca las células cancerosas para su destrucción por las células CAR T específicas de FITC. Este tratamiento prolongó la supervivencia en múltiples tumores sólidos murinos singénicos y también provocó la regresión del tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor sólido humano. Es importante destacar que la citotoxicidad de CAR T dirigida por amph-FITC desencadenó la liberación de antígenos tumorales y la activación de DC, lo que condujo al cebado de células T antitumorales endógenas. Esta inmunidad endógena fue suficiente para proteger de la reexposición al tumor y proporciona un mecanismo para el ataque inmunitario endógeno contra lesiones no inyectadas.

Esta estrategia permite el control de la orientación del tumor a través de la administración local de TI de amph-FITC, lo que garantiza que las células CAR T puedan reconocer de manera efectiva las células cancerosas al tiempo que limitan la toxicidad fuera del tumor en el objetivo en los tejidos sanos distales. Estudios anteriores han utilizado células CAR T específicas de FITC y han redirigido estas células contra los tumores mediante la vinculación de FITC con anticuerpos dirigidos contra el tumor55,56,57 o metabolitos como el folato58,59,60. Pero la limitación clave de tales enfoques es que carecemos de antígenos diana adecuados en la mayoría de los cánceres sólidos para la generación de dichos cambios. Las células T FITC-CAR se han redirigido contra tumores utilizando anticuerpos anti-CD19 o anti-CD20 acoplados a FITC55,56, pero estos antígenos se expresan solo en un subconjunto de leucemias y linfomas, y ya tenemos productos de células T CAR eficaces aprobados en esta configuración. Múltiples estudios han redirigido las células T FITC-CAR utilizando el anticuerpo dirigido contra HER2 trastuzumab acoplado a FITC55,57, pero se ha demostrado en la clínica que las células T CAR basadas en trastuzumab tienen el potencial de toxicidad letal en pacientes debido a su bajo nivel de expresión. de HER2 en células epiteliales de pulmón9. Esta es una preocupación general con los antígenos asociados a tumores como HER2, EGFR y receptor de folato. A pesar de los intensos esfuerzos en los campos terapéuticos de anticuerpos y células T con CAR, hasta ahora ha fracasado en gran medida la identificación de antígenos de superficie celular verdaderamente específicos de tumores y ampliamente orientables. Además, incluso si los ligandos dirigidos, como los anticuerpos conjugados con FITC, se inyectaran intratumoralmente como se realizó aquí para superar estas preocupaciones, enfrentan el desafío adicional de que la expresión del antígeno tumoral puede variar ampliamente de un paciente a otro, incluso dentro de un tipo de tumor determinado (como EGFRvIII en glioblastoma11 ).

Aquí mostramos un enfoque totalmente agnóstico del antígeno tumoral que no se basa en la identificación de antígenos de superficie específicos de células cancerosas. Además, la inserción de membrana por amph-FITC debería permitir la redirección de células CAR T contra tumores de manera uniforme en todos los pacientes y tipos de tumores, abordando el desafío de la heterogeneidad de expresión de antígenos. Aunque las células cancerosas son capaces de desarrollar resistencia a la terapia celular adoptiva dirigida a proteínas expresadas de forma nativa por mutación o regulación a la baja del antígeno objetivo, esperamos que tales mecanismos de resistencia sean mucho más desafiantes con la inserción de membrana CAR-ligando. Como hemos demostrado previamente21, el proceso de etiquetado de ligandos anfóteros es altamente modular; aunque este estudio se ha realizado con FITC como antígeno modelo, FITC podría intercambiarse por una serie de otros ligandos, incluidos, entre otros, un antígeno proteico o peptídico, u otras moléculas pequeñas. El ligando amph-FITC es una entidad molecular simple y bien definida fácilmente susceptible de fabricación GMP. Los linfocitos CAR T específicos de ligando pueden diseñarse y expandirse utilizando los flujos de trabajo existentes, sin modificar la producción de vectores virales o el cultivo de linfocitos T ex vivo. El DSPE-PEG de polímero de lípidos es un componente central de medicamentos aprobados como Doxil61, con un perfil de seguridad establecido. Además, según sea necesario, la terapia de combinación con una vacuna de amph-ligand sería perfecta y solo requeriría la adición de un adyuvante de vacuna adecuado, como el agonista de STING que se usa aquí.

Están surgiendo pruebas de la capacidad de la citotoxicidad mediada por células CAR T para provocar la propagación de antígenos en modelos de tumores sólidos murinos singénicos21,22,23,24,25, incluso cuando se emplean regímenes de LD antes de la transferencia adoptiva. Aunque la evidencia en pacientes ha sido más limitada, se ha informado la inducción de nuevas respuestas de anticuerpos después de la terapia con células T CAR en el cáncer de páncreas62, y un informe de caso de un paciente tratado con células T CAR T HER2 para rabdomiosarcoma metastásico documentó la expansión oligoclonal de células T endógenas63 , lo que sugiere la propagación del antígeno. Aquí encontramos que el reconocimiento CAR T del amph-ligand insertado en la membrana provocó expansiones significativas en la respuesta endógena de células T antitumorales, que protegió a los ratones curados de la reexposición con células cancerosas parentales en ausencia del ligando CAR e indujo actividad antitumoral contra lesiones distales.

Un inconveniente potencial de este enfoque es la necesidad de una inyección local de ligando anf. Aunque esto puede limitar la aplicación de la terapia a tumores accesibles, las inmunoterapias son cada vez más comunes, con un aumento exponencial en el número correspondiente de ensayos clínicos64,65. Con el desarrollo de terapias adicionales, las tecnologías utilizadas para la administración de estos agentes (como las inyecciones guiadas por imágenes) también se están desarrollando y aplicando más ampliamente66. Mientras que los tumores viscerales son accesibles para la inyección, las inyecciones repetidas pueden ser menos factibles, y estamos investigando activamente la cantidad mínima de inyecciones necesarias para inducir la regresión del tumor mediante la terapia Amph-FITC/CAR T, y anticipamos que tan solo dos o tres inyecciones pueden Ser suficiente. Encontramos que el tratamiento una vez cada 6 días fue equivalentemente efectivo a la dosificación cada 3 días (Datos extendidos Fig. 3a). En particular, la inmunoterapia con el virus oncolítico talimogén laherparepvec, aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU., se administra cada 2 semanas durante al menos 6 meses después de la dosificación inicial.

Una preocupación adicional es que la decoración de ligandos anfibios decorará todas sus poblaciones celulares y no solo las células cancerosas. Demostramos que los pretratamientos de LD comúnmente utilizados antes de la transferencia de células T con CAR ya eliminan la mayoría de las células inmunitarias, lo que reduce la preocupación sobre la redirección de células T con CAR contra los infiltrados de células inmunitarias del huésped. Además, las poblaciones de células ti, como los macrófagos asociados a tumores, las células mieloides y los fibroblastos asociados con el cáncer, son altamente inmunosupresores y promotores de tumores, y muchos otros estudios han demostrado que su eliminación impulsa la respuesta inmunitaria antitumoral67,68,69,70,71 . Por lo tanto, la decoración de amph-FITC y la muerte mediada por CAR T de estas poblaciones de células huésped, en lugar de representar una toxicidad, probablemente promoverían el rechazo del tumor.

En resumen, hemos mostrado una terapia de células T con CAR universal totalmente independiente del tumor basada en la inserción en la membrana de ligandos anf administrados intratumoralmente. Este enfoque exhibió una potente actividad antitumoral contra múltiples tipos de tumores y en huéspedes inmunocompetentes. Sorprendentemente, la terapia de células T con CAR dirigida por ligandos anfásicos también indujo una respuesta de células T endógenas. Aunque la terapia con células CAR T ha tenido una eficacia impresionante en el tratamiento de leucemias y linfomas que expresan antígenos ubicuos como CD19, la administración de ligandos amph-CAR proporciona una estrategia para el tratamiento universal de tumores sólidos en los que la selección de antígenos tumorales es más problemática, ampliando en gran medida la capacidad del paciente. población que podría beneficiarse de la terapia celular adoptiva.

DSPE-PEG-FITC (PEG MW 1, 2, 3,4 y 5 kDa) se adquirió de Creative PEGworks (n.º de catálogo PLS-9926 a 9929). DSPE-FITC y DSPE-PEG10k-FITC se adquirieron de Nanosoft Polymers (n.º de cat. 10805) y Nanocs (n.º de cat. PG2-DSFC-10k), respectivamente. El di-GMP cíclico se adquirió de Invivogen.

Las células Phoenix-ECO, B16F10 y MSTO-211H se adquirieron de ATCC. Las células 293T se adquirieron de Clontech. Las células MC38 y CT-2A-Luc fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Dane Wittrup del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) y el Dr. Thomas Seyfried del Boston College, respectivamente. Las células CT-2A y MSTO-211H se transdujeron lentiviralmente para expresar de manera estable EGFRvIII murino y tdTomato o mesotelina humana, respectivamente, con selección usando puromicina y clasificación en un clasificador de células BD FACSAria III. Células B16F10, CT-2A, MC38, 293T y Phoenix-ECO se cultivaron en medio completo de Eagle modificado por Dulbecco (Cytiva; suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 U ml-1 de penicilina y 100 mg ml-1 de estreptomicina). Se cultivaron células MSTO-211H en medio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Cytiva).

Todos los CAR murinos contenían el péptido señal CD8α (MALPVTALLLPLALLLHAARP) seguido de una etiqueta Myc (EQKLISEEDL, para el análisis de la expresión de la superficie celular) y un scFv específico de FITC derivado del anticuerpo monoclonal clon 4m5.3 (ref. 36), E2 (ref. . 37) o E2 con una mutación His-H58-Ala72 ('E2.7'). Los dominios extracelulares se fusionaron con los dominios transmembrana y bisagra de CD8α, los dominios coestimuladores CD28 o 4-1BB y un dominio intracelular CD3ζ, y se clonaron en un vector retroviral pMIG. Para los estudios de imágenes de bioluminiscencia, las células T se cotransdujeron con MI-FLuc-IRES-mCherry, que fue un regalo de Xiaoping Sun (Addgene plásmido n.° 75020; http://n2t.net/addgene:75020; RRID: Addgene_75020). Todos los CAR humanizados se clonaron de forma similar a la anterior utilizando dominios humanizados, con la excepción de que los CAR que contenían dominios coestimuladores de CD28 se emparejaron con un dominio transmembrana de CD28. Los CAR humanizados se clonaron en el vector lentiviral pLenti6.3 (ThermoFisher) bajo el control de un promotor de citomegalovirus. Para los estudios de imágenes de bioluminiscencia, las células T se cotransdujeron con pCDH-EF1-Luc2-P2A-tdTomato, que fue un regalo de Kazuhiro Oka (Addgene plásmido n.º 72486; http://n2t.net/addgene:72486; RRID: Addgene_72486 ). La expresión de todos los CAR se determinó mediante tinción de citometría de flujo para la etiqueta Myc utilizando un anticuerpo anti-etiqueta Myc (9B11, conjugado de PE, señalización celular) con análisis en un citómetro de flujo BD LSR-II.

Para producir retrovirus ecotrópicos para la transducción de células T murinas, se transfectaron células Phoenix-ECO con una proporción de 1:3 de pCL-Eco y plásmido de transferencia utilizando un kit de transfección de mamíferos CalPhos (Takara Bio). Las células T murinas primarias se aislaron de bazos de ratones WT o CD45.1+ C57BL/6 utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón EasySep o el kit de aislamiento de células T de ratón EasySep (StemCell Technologies) y se activaron durante 48 h en seis pocillos no Placas tratadas con cultivo de tejidos (TC) recubiertas previamente con 0,5 mg ml-1 de anti-CD3 (BioXCell, clon 2C11) y 5 mg ml-1 de anti-CD28 (BioXCell, clon 37.51) a 106 células ml-1 con 5 ml por pocillo . Las células T se cultivaron en RPMI completo con piruvato de sodio 1 mM, β-mercaptoetanol 0,05 mM y 1 × aminoácidos no esenciales de medio esencial mínimo (ThermoFisher) suplementado con 10 ng ml−1 de IL-2 murina (BioLegend). Después de la activación, las células T se transdujeron mediante spinfection a 3 × 106 células por pocillo en medio completo de células T durante 90 min a 1100 gy 32 °C con 10 ng ml-1 de polibreno (Sigma) en placas no tratadas con TC antes de la transducción. recubierto con 15 mg ml−1 de RetroNectin (Takara Bio). La expresión de CAR se analizó mediante citometría de flujo 24 h después de la transducción; Las células T se mantuvieron a una densidad celular de 106 células ml-1, luego se usaron para transferencia adoptiva o ensayos in vitro a las 48 h después de la transducción.

Para las CAR humanizadas, el lentivirus pseudotipado G del virus de la estomatitis vesicular se produjo mediante la transfección de células 293T con psPAX2, pMD2.G y plásmido de transferencia en una proporción de 2:1:2 utilizando el reactivo de transfección Effectene (QIAGEN). Las células T humanas primarias se aislaron de capas leucocitarias de donantes sanos (Massachusetts General Hospital Blood Donor Center) usando el kit de aislamiento de células T CD8+ humanas EasySep o el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (StemCell Technologies) y se activaron durante 48 h usando Dynabeads Human T- Activador CD3/CD28 (ThermoFisher) en una proporción de microesferas por celda de 3:1. Las células T humanas se cultivaron en RPMI completo suplementado con 30 U ml−1 de IL-2 humana (PeproTech). Después de la activación, las células T se transdujeron y tiñeron como se describió anteriormente, y se usaron para transferencia adoptiva o estudios in vitro a las 48–72 h después de la transducción.

Para el etiquetado in vitro de células tumorales con amph-FITC, las células tumorales se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y se incubaron a una densidad celular de 106 células ml-1 durante 30 min a 37 °C con DSPE-PEGx- FITC, donde x = 0, 1, 2, 3,4 o 10 kDa (Creative PEGworks) en PBS. Para los cocultivos, las células diana se marcaron simultáneamente con amph-FITC 100 nM y CellTrace Violet (ThermoFisher); Se sembraron 20 000 células diana por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos con linfocitos CAR T en las proporciones E:T indicadas. Después de una incubación de 16 h, las células se tiñeron con rojo SYTOX (ThermoFisher) para citometría de flujo, y se cuantificó el IFN-γ en el sobrenadante utilizando un kit ELISA sin recubrimiento de IFN gamma de ratón (Invitrogen).

Para evaluar la biodistribución de amph-FITC después de su inyección, se inocularon sc ratones C57BL/6 (6–8 semanas, Jackson Laboratory, n = 5) con 106 células tumorales B16F10. Una vez que los tumores tenían un área de ~25 mm2, se inyectaron intratumoralmente 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks). Después de 24 h, los tejidos (tumor, hígado, riñón, bazo, médula ósea y LN axilares e inguinales) se homogeneizaron en etanol (pH 8,0–8,5) y se cuantificó la fluorescencia del sobrenadante en un lector de placas FlexStation 3 (Molecular Devices, excitation 495 nm, emisión 519 nm).

Para los estudios de localización celular, a los ratones portadores de tumores MC38 se les inyectó intratumoralmente 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC y, 24 h más tarde, los tumores se digirieron enzimáticamente a 37 °C durante 30 min con 1 mg ml−1 de colagenasa D y 0,2 mg ml−. 1 ADNasa I en medio RPMI completo antes de la disociación mecánica a través de un filtro celular de 70 µm. Las muestras se tiñeron con los siguientes anticuerpos: PE-Cy7 anti-CD45 (clon 30-F11, BioLegend), BV605 anti-CD11b (clon M1/70, BioLegend), PE anti-CD11c (clon N418, BioLegend), BV711 anti- ratón CD3 (clon 17A2, BioLegend), BV421 anti-CD8α (clon 53-6.7, BioLegend) y Alexa Fluor 647 anti-FITC (Jackson ImmunoResearch) y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa.

Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo el cuidado de animales del instituto de la División de Medicina Comparada del MIT, se utilizó un protocolo de animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales del MIT y se utilizó un protocolo aprobado por el comité de acuerdo con las pautas federales, estatales y locales.

Se inocularon ratones C57BL/6 WT, CD45.1+, Batf3 knockout (KO) y Rag1 KO (Jackson Laboratory, 6–8 semanas de edad) con 106 B16F10, 106 MC38 o 3 × 106 CT-2A células tumorales sc en el flanco . Una vez que los tumores crecieron a ~25 mm2 de área, los ratones se sometieron a una dosis no mieloablativa de 5 Gy de TBI administrada por una fuente de radiación gamma [137Cs], 24 h antes de la transferencia adoptiva de 107 células CD45.1+ CAR T por vía intravenosa (iv) a través de la vena de la cola. Un día después, los ratones se vacunaron sc en la base de la cola con 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) y 25 µg de di-GMP cíclico (Invivogen), y se vacunaron tres dosis en total, una vez por semana. Se administró una inyección (it) de 10 nmol de amph-FITC comenzando el día después de la primera vacunación y continuando cada 3 días.

Para los estudios de xenoinjerto, se inocularon ratones NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) (Jackson Laboratory) de 6 a 12 semanas de edad con 3 × 106 células MSTO-211H sc en el flanco. Una vez que los tumores crecieron hasta ~25 mm2, los ratones se transfirieron adoptivamente con 107 células CAR T iv a través de la vena de la cola. Se administró una inyección (it) de 10 nmol de amph-FITC comenzando el día después de la transferencia adoptiva y continuando cada 3 días.

Para todos los estudios, la progresión del tumor se controló mediante mediciones de calibre. La supervivencia se evaluó a lo largo del tiempo hasta que los tumores superaron los 200 mm2 de área, se ulceraron gravemente durante >1 semana o experimentaron una pérdida de peso >20 %. Para monitorear el tráfico de células CAR T que expresan FLuc, se inyectaron ratones sc en la nuca con 150 mg kg-1 de sal de d-luciferina K+ (Perkin-Elmer) y se tomaron imágenes en un Xenogen IVIS Spectrum. Antes de obtener imágenes, se depiló la espalda de los ratones C57BL/6 para mejorar la sensibilidad de la señal.

Para la cuantificación de CAR T murino y células T endógenas en sangre periférica, tumor y bazo, los tejidos se homogeneizaron a través de un filtro de células de 70 µm (con la excepción de los tumores MC38, que requerían digestión enzimática como se describe anteriormente). Las muestras de sangre y bazo se incubaron con tampón de lisis ACK (Gibco) para aislar células mononucleares de sangre periférica y esplenocitos, respectivamente. A continuación, las muestras se tiñeron con PE anti-CD45.1 (clon A20, BioLegend), BUV805 anti-CD8α (clon 53-6.7, BioLegend), Alexa Fluor 647 anti-CD4 (clon GK1.5, BioLegend), APC-Cy7 anti -CD45.2 (clon 104, BioLegend) y LIVE/DEAD Fixable Aqua (ThermoFisher) y analizado en un citómetro de flujo BD LSRFortessa.

Para los estudios de captación de antígenos, los tumores y los LN se tiñeron con Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend), BUV395 anti-CD45 (clon 30-F11, BD Biosciences), BV421 anti-CD103 (clon 2E7, BioLegend), BV605 anti-Ly6C ( clon HK1.4, BioLegend), BV711 anti-F4/80 (clon BMB, BioLegend), BV785 anti-CD11b (clon M1/70, BioLegend), Alexa Fluor 700 anti-CD86 (clon GL1, BioLegend), PE-Cy7 anti-IA/IE (clon M5/114.15.2, BioLegend), APC anti-CD24 (clon 30-F1, BioLegend), APC-Cy7 anti-CD11c (clon N418, BioLegend), PE-Cy5 anti-CCR7 (clon 4B12, BioLegend), PerCP-Cy5.5 anti-CD169 (clon 3D6.112, BioLegend) y BUV737 anti-CD8α (clon 53-6.7, BD Biosciences).

Para la cuantificación de células CAR T humanas en sangre periférica, bazo y tumor, los tejidos se procesaron como se describe anteriormente, luego se tiñeron con LIVE/DEAD Aqua, BUV496 anti-CD4 (clon SK3/Leu3a, BD Biosciences), BUV805 anti-CD8α ( clon SK1, BD Biosciences), PE anti-myc tag (clon 9B11, Cell Signaling) y APC-Cy7 anti-CD45 (clon 2D1, BioLegend).

Los bazos se procesaron como se describe anteriormente. Las células diana CT-2A y B16F10 se pretrataron con 100 U ml-1 y 500 U ml-1 de IFN-γ murino (Abcam), respectivamente, durante 16 h, luego se irradiaron a 120 Gy con una fuente de radiación gamma [137Cs]. Se cocultivaron esplenocitos (varias diluciones a partir de 106 células por pocillo) con 25 000 células diana por pocillo durante 16 h, y se realizó ELISPOT utilizando un conjunto Mouse IFN-γ ELISPOT (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante.

Los tejidos (tumor, pulmón, hígado y riñón) se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 24 ha 4 °C. Para los estudios de inmunofluorescencia, los tumores se incluyeron en agarosa a baja temperatura de gelificación al 3 % (Sigma-Aldrich) antes de procesarlos en secciones de 100 µm en un vibratomo Leica VT1000S. Las secciones de tejido se permeabilizaron con albúmina sérica bovina al 2 % y Triton-X 100 al 0,2 % en PBS durante 1 hora a 37 °C antes de teñirlas con Alexa Fluor 647 o anti-FITC conjugado con DyLight 405 (Jackson ImmunoResearch) durante 16 horas a 37 °C. °C, seguido de varios lavados con PBS. La microscopía confocal se realizó en un microscopio de barrido láser confocal Olympus FV1200. Para la inmunohistoquímica de la distribución tumoral de amph-FITC, las muestras fijadas con paraformaldehído se incluyeron en parafina y se obtuvieron secciones de 10 µm. Las secciones se tiñeron con etiqueta anti-myc (9B11, Cell Signaling) o anti-CD45.1 (A20, BioLegend). Para los estudios de inmunohistoquímica, los tumores se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima y se procesaron en secciones de 14 μm de espesor en un criostato Leica CM1950. Las secciones de tejido se permeabilizaron con albúmina sérica bovina al 2 % y Triton-X 100 al 0,2 % en PBS durante 2 h a temperatura ambiente antes de teñirlas con anti-Trp1 biotinilado (TA99) (obsequio del Dr. Dane Wittrup del MIT), estreptavidina conjugada con BV421 ( Biolegend), anti-FITC conjugado con Alexa Fluor 647 (clon SPM395, Novus Biologicals) y CellMask Orange Plasma Membrane Stain (Invitrogen). Las imágenes se realizaron en un microscopio confocal espectral Leica SP8.

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 9. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (sd). Para evaluar la significación estadística, se utilizaron las siguientes pruebas: entre dos grupos, la prueba t de Student de dos colas no pareadas o la prueba U de Mann-Whitney; para comparaciones múltiples, análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con comparaciones múltiples de Tukey; para medidas repetidas en un curso de tiempo, ANOVA de dos vías con medidas repetidas; para las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Todos los valores de P se proporcionan en las figuras o en sus leyendas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Cualquier dato que respalde los hallazgos de este estudio también está disponible de los autores correspondientes a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al Centro de Biotecnología Swanson del Instituto Koch por el apoyo técnico, específicamente las instalaciones centrales de imágenes y pruebas preclínicas, citometría de flujo, microscopía e histología. Las figuras 1a, 3a, 6a y 7b se crearon con Biorender.com. AQZ recibió el apoyo del premio número T32GM007753 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales. Este trabajo fue apoyado en parte por el Marble Center for Cancer Nanomedicine, el NIH (premio CA247632), la Fundación Mark para la Investigación del Cáncer, el Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard, y la subvención de apoyo (núcleo) del Instituto Koch P30-CA14051 del Instituto Nacional del Cáncer. DJI es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Instituto Koch para la Investigación Integral del Cáncer, Cambridge, MA, EE. UU.

Angela Q. Zhang, Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Wuhbet Abraham, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff, Laura Maiorino, Coralie M. Backlund, Aereas Aung, Mariane Melo, Na Li, Shengwei Wu y Darrell j irvine

Departamento de Ciencias de la Salud y Tecnología, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Ángela Q. Zhang

Departamento de Biofísica, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Ángela Q. Zhang

Departamento de Ingeniería Biológica, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff y Darrell J. Irvine

Instituto Ragon del MIT, MGH y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Darrell J. Irvine

Instituto Médico Howard Hughes, Chevy Chase, MD, EE. UU.

Darrell J. Irvine

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DJI y AQZ concibieron el concepto de it amph-ligand y escribieron el artículo. Experimentos diseñados por AQZ, AH, LEC, VM y DJI. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP y ANW realizaron experimentos de cocultivo y etiquetado amph-FITC in vitro. AQZ, AH, LEC, LM y CMB realizaron experimentos de marcado con amph-FITC in vivo. AQZ, LEC, VM y WA realizaron experimentos de tráfico de células T con CAR in vivo. AQZ, LM, AH y AA realizaron experimentos de histología. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP, ANW, LM, CMB, MM, NL y SW realizaron estudios terapéuticos in vivo en modelos singénicos. AQZ y LTP realizaron estudios terapéuticos in vivo en modelos de ratón con xenoinjerto humano. AQZ, LEC y VM realizaron experimentos de difusión de epítopos.

Correspondencia a Darrell J. Irvine.

AQZ, AH, LEC y DJI han presentado una solicitud de patente presentada por el MIT en relación con los datos presentados en este trabajo. DJI es consultor y accionista de Elicio Therapeutics, que tiene los derechos de licencia de la propiedad intelectual del MIT mencionada anteriormente. Los demás autores no declaran intereses.

Nature Biomedical Engineering agradece a Stephen Gottschalk, Donald O'Rourke y Masataka Suzuki por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a Cronología de la terapia en ratones C57BL/6 con tumor MC38. b, c Células CAR T en sangre periférica (b, día 4) y tumor (c, día 11) (n = 5 animales/grupo). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Las barras de error representan la desviación estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Datos fuente

a Grupos de ratones C57BL/6 que portaban tumores B16F10 (n = 5 animales/grupo) fueron linfodeplecionados con 250 mg/kg de ciclofosfamida y 50 mg/kg de fludarabina administrados un día antes de la transferencia celular adoptiva, seguido de tratamiento con amph-FITC intratumoral y amph -Refuerzo con vacuna FITC según indicación. b Comparación del crecimiento tumoral en ratones que no recibieron tratamiento (n = 7) frente a animales que recibieron un régimen de reducción de linfocitos de 5 Gy TBI (n = 8) siete días después de haber sido inoculados con 3 × 106 células CT-2A. Los valores de p se determinaron mediante ANOVA de dos vías. Las barras de error representan el error estándar de la media. ns, no significativo; ** p < 0,01.

Datos fuente

a Comparación del crecimiento tumoral (izquierda) y la supervivencia (derecha) en ratones portadores de tumores CT-2A tratados con células CAR T seguidas de amph-FITC intratumoral cada 3 o 6 días (n = 5 animales/grupo). b Comparación del crecimiento tumoral (izquierda) y la supervivencia (derecha) en ratones portadores de tumores CT-2A tratados con células T FITC CAR preparadas en mIL-2 o una combinación de mIL-7 y mIL-15 (n = 5 animales/grupo ). Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías (curvas de crecimiento tumoral) y prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) (curvas de supervivencia). Las barras de error representan la desviación estándar. ns, no significativo; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Datos fuente

a Cronología de la terapia en ratones C57BL/6 portadores de tumores CT-2A. b Peso corporal de ratones C57BL/6 con tumor B16F10 durante el curso de la terapia (n = 5 animales/grupo). c, d Cuantificación de citocinas séricas (c, n = 5 animales/grupo) y ALT y AST séricas (d, n = 7 animales/grupo) a los 3 y 12 días posteriores a la transferencia adoptiva. Los valores de p se determinaron mediante ANOVA de dos vías (curvas de peso corporal) o la prueba t de Student no pareada. Las barras de error representan el error estándar de la media (b) y la desviación estándar (c). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Datos fuente

a Citotoxicidad in vitro de células T con CAR de FITC con células de cáncer de mesotelioma humano amph-FITC+ MSTO-211H en una proporción de ET de 1:1. b Comparación de la señal de luciferasa de células T con CAR fLuc+ a lo largo del tiempo en ratones tratados solo con células T con CAR T CD8+ 4m5.3-h28z o una combinación de células T con CAR T CD4+ y CD8+ (n = 5 animales/grupo). c, d Estrategia de activación para inmunofenotipificar células T con CAR humanas (c) y composición fenotípica de células T con CAR recuperadas de bazos de ratones NSG 23 días después de la transferencia adoptiva (d, n = 5 animales/grupo). e Cuantificación de células T CAR CD4+ y CD8+ en el bazo el día 40 después de la transferencia adoptiva (n = 5 animales/grupo). f Resplandor de ratón completo a lo largo del tiempo como sustituto de la expansión de células CAR T (n = 5 animales/grupo). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Datos fuente

Figs suplementarias. 1–5.

Fuente de datos para todas las cifras.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhang, AQ, Hostetler, A., Chen, LE et al. Redirección universal de células CAR T contra tumores sólidos a través de ligandos insertados en la membrana para CAR. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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Recibido: 19 Abril 2022

Aceptado: 01 mayo 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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